【教学课件】选修课 临床检验 9荧光定量PCR在临床实验室诊断中的应用.ppt
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1、荧光探针定量PCR技术在临床实验室诊断中的应用重庆医科大学附属第一医院检验科重庆医科大学附属第一医院检验科 胥飚胥飚38,200,000(PCR)8,800,000(周杰伦)内容提要一、基因诊断技术在医学检验中的地位一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量二、荧光探针定量PCR的技术特点的技术特点三、荧光探针定量三、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用在临床医学中的应用临床实验医学发展 三个时代三个时代 标志技术标志技术 性质性质生化诊断时代生化诊断时代 生化分析生化分析 表象表象免疫学诊断时代免疫学诊断时代 酶免、放免酶免、放免 表象表象分子分子(基因基因)诊断时代诊断时代 基因体
2、外扩增基因体外扩增(PCR)本质本质基因诊断技术的发展及在临床诊断中的地位 基因诊断(分子诊断):以核酸作为诊断的物质基础基因诊断(分子诊断):以核酸作为诊断的物质基础 主要包括:主要包括:遗传性疾病遗传性疾病 有遗传趋向疾病的连锁分析有遗传趋向疾病的连锁分析 疾病及肿瘤易感基因的分析疾病及肿瘤易感基因的分析 病原体的检测病原体的检测 亲子鉴定和个人认定亲子鉴定和个人认定 人类基因组计划(人类基因组计划(HGP)与基因诊断)与基因诊断 基因诊断技术:基因诊断技术:PCR技术为其标志性技术技术为其标志性技术聚合酶链反应(聚合酶链反应(PCRPCR)PCR:Polymerase Chain Rea
3、ction基因体外扩增技术Saiki PK 等 1985年 Science 230:1350Mullis K 1993年 诺贝尔化学奖PCR循环次数与循环次数与DNA产量关系产量关系循环次数 DNA的链数1 22-2 22 23-2 63 24-2 1410 211-2 204615 216-2 6553420 221-2 209715025 226-2 67,108,86430 231-2 2,147,483,646荧光探针定量PCR的技术特点第一代第一代PCR技术:变性、退火、延伸技术:变性、退火、延伸 结果判断:电泳结果判断:电泳 缺点:假阳性(污染)、缺点:假阳性(污染)、假阴性(灵敏
4、度低)假阴性(灵敏度低)定性检测定性检测第二代第二代PCR技术:常规技术:常规PCR+探针探针 例如:荧光探针例如:荧光探针PCR技术技术 PCR-ELISAll 荧光探针定量荧光探针定量PCR技术的技术的原理原理及过程及过程分分 子子 学学 基基 础:常规础:常规PCR+荧光探针(荧光探针(TaqMan荧光探针荧光探针)酶酶 学学 基基 础:础:Taq酶的酶的5 3外切核酸酶活性外切核酸酶活性荧光化学基础:荧光报告基团和淬灭基团标记探针荧光化学基础:荧光报告基团和淬灭基团标记探针 荧光共振能量转移原理荧光共振能量转移原理(FRET)Ct值值:C代表代表Cycle,t代表代表threshold
5、,其其 含义是:每个反应管内的荧光信号到达含义是:每个反应管内的荧光信号到达 设定的阈值时所经历的循环数。设定的阈值时所经历的循环数。l定定 量量 的的 实实 现现:l 1、荧光探针与扩增产物结合、荧光探针与扩增产物结合l 2、Taq酶外切作用,探针裂解,荧光酶外切作用,探针裂解,荧光 被激发被激发l 3、荧光信号的检测、荧光信号的检测l 4、荧光强度与定量核酸模板相关性、荧光强度与定量核酸模板相关性l 5、实时定量与终产物定量、实时定量与终产物定量l l l l荧光定量PCR技术的主要优点一、真正的样品原始核酸模板的准确定量一、真正的样品原始核酸模板的准确定量二、定量范围宽(二、定量范围宽(
6、01010/ml),无需梯度稀释,无需梯度稀释三、封闭状态检测,避免扩增产物污染三、封闭状态检测,避免扩增产物污染四、探针使用使特异性更强四、探针使用使特异性更强五、光谱分析技术使敏感性更高五、光谱分析技术使敏感性更高六、仪器读数,结果判断客观真实六、仪器读数,结果判断客观真实七、无需七、无需PCR后处理,操作更简便、快速后处理,操作更简便、快速八、数据电脑管理,利于医院管理八、数据电脑管理,利于医院管理荧光定量荧光定量PCR技术检测的报告形式技术检测的报告形式一、报告形式:一、报告形式:荧光定量荧光定量PCR检测的报告以:检测的报告以:“拷贝数拷贝数”(copy)二、拷贝数的意义:二、拷贝数
7、的意义:表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量。表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量。三、拷贝数与病原体的关系:三、拷贝数与病原体的关系:拷贝数与病原体的数量成正相关拷贝数与病原体的数量成正相关 一般来说:细菌是单拷贝的,病毒是多拷贝的。一般来说:细菌是单拷贝的,病毒是多拷贝的。检测结果分析荧光定量荧光定量PCR检测结果的正常值?检测结果的正常值?外源基因:正常值:外源基因:正常值:0拷贝拷贝 0拷贝:根据临床表现拷贝:根据临床表现内源基因:正常值:参照正常细胞相关基因表达水平内源基因:正常值:参照正常细胞相关基因表达水平FQ-PCR在临床医学中的应用1、病原体的定量检测;、病原体的定量
8、检测;2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测;的检测;3、遗传病基因的检测;、遗传病基因的检测;4、与疾病相关的各种蛋白质(细胞因子、酶、与疾病相关的各种蛋白质(细胞因子、酶、激素、受体)的基因表达的定量检测;激素、受体)的基因表达的定量检测;5、药物疗效的考核手段。、药物疗效的考核手段。6、建立病原体的分子诊断标准、建立病原体的分子诊断标准FQ-PCR在病原体检测中的应用一、肝炎病毒定量检测一、肝炎病毒定量检测二、优生优育相关项目检测二、优生优育相关项目检测三、结核杆菌及呼吸道病原体检测三、结核杆菌及呼吸道病原体检测四、性病病原体检测四、性病病原体检测129
9、129例例HBVHBV定量检测结果定量检测结果ELISA 总数总数 阳性例数阳性例数 阳性率阳性率 平均数量平均数量 范围范围大三阳大三阳 81 81 100%3.98 108/ml 2.0 1078.0 1010/ml小三阳小三阳 48 39 81%3.30 106/ml 1.2 1033.8 106/mlHBV病毒载量与乙肝感染各期病毒载量与乙肝感染各期 平均拷贝数平均拷贝数 HBeAg阳性慢性乙肝阳性慢性乙肝 47例例 8.3X108拷贝拷贝/ml 干扰素治疗后干扰素治疗后HBeAg转阴转阴 40例例 6.2X103 拷贝拷贝/ml 非活动性非活动性HBsAg携带者携带者 57例例 5.
10、6X103 拷贝拷贝/ml HBV阳性痊愈后阳性痊愈后12个月个月 42例例 0 拷贝拷贝/ml Clin Diagn Lab Immunol 2000 Mar;7(2)298-300 肝炎病毒载量与疗效肝炎病毒载量与疗效 有专家提出有专家提出103/ml做为临床治愈标准之一做为临床治愈标准之一 肝炎病毒载量与干扰素治疗肝炎病毒载量与干扰素治疗 Kato(93):HCV高,干扰素不敏感高,干扰素不敏感 HCV低,干扰素敏感低,干扰素敏感 Marcellin(95):HBV100pg/ml组:组:11/30转阴转阴 HBV 100pg/ml组:组:1/30转阴转阴 根据病毒载量选择药物根据病毒载
11、量选择药物 拉咪呋定有显著降低高病毒载量作用拉咪呋定有显著降低高病毒载量作用 筛选肝炎治疗药物筛选肝炎治疗药物 中医药的现代化研究中医药的现代化研究 肝炎病毒传播途径肝炎病毒传播途径 垂直传播(母婴)垂直传播(母婴)血清与唾液、乳汁和精液肝炎病毒量的相关性血清与唾液、乳汁和精液肝炎病毒量的相关性 肝炎病毒(基因型、载量)与肝癌发生的关系肝炎病毒(基因型、载量)与肝癌发生的关系HIV载量与传染 选择选择415对性伴侣(来自对性伴侣(来自15,127人)人)观察时间观察时间30个月;个月;男男 女女12.0%,女,女 男男11.8%;51对性伴侣(对性伴侣(1,500copies/millilit
12、er)没有证据没有证据 传染;传染;The New England Journal of Medicine 342:921,Mar 30,2000EB病毒载量与鼻咽癌 血浆血浆EBV载量与鼻咽癌显著相关载量与鼻咽癌显著相关 鼻咽癌病人血浆鼻咽癌病人血浆EBV与肿瘤复发相关与肿瘤复发相关 10个复发病人:个复发病人:32,250copies/ml 15个二年持续缓解病人:个二年持续缓解病人:0 copies/ml 17个随访病人:临床恶化前个随访病人:临床恶化前6月显著升高月显著升高 Cancer Res,1999 Nov,59:21,5452-5优生优育相关项目检测 引起宫内感染病原体的定量检
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