《切片技术》PPT课件.ppt

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1、显微技术显微技术(光镜光镜)江苏大学江苏大学 基础医学与医学技术学院基础医学与医学技术学院 组织胚胎学系组织胚胎学系卢小东卢小东 1meter1meter100mm100mm10mm10mm1mm1mm100um100um10um10um1um1um100nm100nm10nm10nm1nm1nm0.1nm0.1nmNakedEyeNakedEyeLightLightMicroscopeMicroscopeElectronElectronMicroscopeMicroscopeOrganismsOrganismsOrgansOrgansCells(20u)Cells(20u)Nucleus(2

2、u)Nucleus(2u)Bacteria(0.5u)Bacteria(0.5u)OrganellesOrganellesVirusesVirusesMacromoleculesMacromoleculesAtomsAtoms.Resolvingpower分辨率：分辨率：光镜：光镜：0.20.2m m电镜：电镜：0.1nm0.1nm显微长度单位显微长度单位millimeter(mm)=10-3metermicrometer(m)=10-6meternanometer(nm)=10-9meter显微镜技术显微镜技术:光镜：光镜：lightmicroscopic,LM电镜：电镜：electroni

3、cmicroscopic,EM透射电镜透射电镜（transmissionelectronmicroscope,TEM）：观察细胞内部结构：观察细胞内部结构扫描电镜扫描电镜（scanningelectronmicroscope,SEM)：观察组织或细胞表面观察组织或细胞表面的立体结构的立体结构qq 组织学的研究技术光学显微镜技术光学显微镜技术 显微镜显微镜1717thth 18th 18th 光学显微镜技术光学显微镜技术 显微镜显微镜18/1918/19thth 19th 19th EyePiecesObjectivesStageLightsourceVol.controlOn-offButto

4、nControlsFinefocuscontrolCoarsefocuscontrol10X4 10X4 低倍观察低倍观察10X10 10X10 中倍观察中倍观察10X40 10X40 高倍观察高倍观察10X100 10X100 油镜油镜 普通生物显微镜的放大倍数普通生物显微镜的放大倍数 光学显微镜原理光学显微镜原理荧光显微镜荧光显微镜是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。相差倒置显微镜相差倒置显微镜是用以观察培养细胞。一般光镜不易是用以观察培养细胞。一般光镜不易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（phasecont

5、rstmicroscope）才能观察。相差显微镜可将厚细）才能观察。相差显微镜可将厚细胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，影像清晰。影像清晰。细胞培养细胞培养光镜标本制备光镜标本制备？光学显微镜技术光学显微镜技术常见标本制备：常见标本制备：HEHE染色，石蜡切片染色，石蜡切片特点：特点：特点：特点：石蜡切片是使石蜡充分浸入组织，组织块变石蜡切片是使石蜡充分浸入组织，组织块变石蜡切片是使石蜡充分浸入组织，组织块变石蜡切片是使石蜡充分浸入组

6、织，组织块变硬，有利于切薄，制作的切片能完好地保存组织硬，有利于切薄，制作的切片能完好地保存组织硬，有利于切薄，制作的切片能完好地保存组织硬，有利于切薄，制作的切片能完好地保存组织原有的结构，透明度好，并可长期保存，有利于原有的结构，透明度好，并可长期保存，有利于原有的结构，透明度好，并可长期保存，有利于原有的结构，透明度好，并可长期保存，有利于显微镜下观察组织图像。这种方法包括以下几个显微镜下观察组织图像。这种方法包括以下几个显微镜下观察组织图像。这种方法包括以下几个显微镜下观察组织图像。这种方法包括以下几个步骤步骤步骤步骤：步骤步骤步骤步骤uu取材固定：取材固定：取材固定：取材固定：福尔马

7、林福尔马林福尔马林福尔马林uu脱水：脱水：脱水：脱水：酒精酒精酒精酒精uu透明：透明：透明：透明：二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯uu包埋：包埋：包埋：包埋：石蜡石蜡石蜡石蜡 uu切片：切片：切片：切片：切片机切片机切片机切片机 uu染色：染色：染色：染色：HEHE取材取材取材取材根据教学和科研的具体要求确定材料、部位根据教学和科研的具体要求确定材料、部位根据教学和科研的具体要求确定材料、部位根据教学和科研的具体要求确定材料、部位和方法和方法和方法和方法材料新鲜材料新鲜材料新鲜材料新鲜组织块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗组织块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗组织块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗组织

8、块的大小：使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部。如制作病理外检、科研切片，入组织内部。如制作病理外检、科研切片，入组织内部。如制作病理外检、科研切片，入组织内部。如制作病理外检、科研切片，取取取取0.10.10.2cm0.2cm即可即可即可即可勿挤压组织块勿挤压组织块勿挤压组织块勿挤压组织块 保持组织原有形态、保持组织清洁保持组织原有形态、保持组织清洁保持组织原有形态、保持组织清洁保持组织原有形态、保持组织清洁 固定固定固定固定 为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组为了阻止组织

9、细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液，织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液，织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液，织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液，常用的固定方法有：常用的固定方法有：常用的固定方法有：常用的固定方法有：小块组织固定法小块组织固定法小块组织固定法小块组织固定法：标本：固定液为：标本：固定液为：标本：固定液为：标本：固定液为1 1：4 42020；最常用的方法，但组织；最常用的方法，但组织；最常用的方法，但组织；最常用的方法，但组织块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，

10、冷藏固定时间适当延块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。注射、灌注固定法：注射、灌注固定法：注射、灌注固定法：注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，某些组织块由于体积过大或固定液极难

11、渗入内部，某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注或需要整个脏器或整个动物体进行固定。这时宜采用注射固定或灌注固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得固定法。将固定液注入血管，经血管分支达整个组织和全身，从而得到充分的固定的目的。到充分的固定的目的。到充分的固定的目的。到充分

12、的固定的目的。固定液：固定液：固定液：固定液：单纯固定液（单纯固定液（单纯固定液（单纯固定液（10%10%甲醛固定液和甲醛固定液和甲醛固定液和甲醛固定液和95%95%乙醇）乙醇）乙醇）乙醇）混合固定液：混合固定液：混合固定液：混合固定液：酒精酒精酒精酒精-甲醛固定液（甲醛固定液（甲醛固定液（甲醛固定液（95%95%酒精酒精酒精酒精9 9份、份、份、份、40%40%的甲醛的甲醛的甲醛的甲醛1 1份）；份）；份）；份）；ZenkenZenken氏液（重铬酸钾氏液（重铬酸钾氏液（重铬酸钾氏液（重铬酸钾2.5g2.5g，升汞，升汞，升汞，升汞5.0g5.0g，蒸馏水，蒸馏水，蒸馏水，蒸馏水100ml,

13、100ml,冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸55mlml）；）；）；）；BouinBouin氏液（苦味酸饱和水溶液氏液（苦味酸饱和水溶液氏液（苦味酸饱和水溶液氏液（苦味酸饱和水溶液25ml,40%25ml,40%甲醛甲醛甲醛甲醛25ml25ml，冰醋酸，冰醋酸，冰醋酸，冰醋酸55mlml）脱水与透明脱水与透明脱水与透明脱水与透明 标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必标本经过固定和冲洗后，组织中含有较多的水分，必须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做须将组织块内

14、的水分置换出来，这一过程叫做须将组织块内的水分置换出来，这一过程叫做脱水脱水脱水脱水。脱水的脱水的脱水的脱水的步骤步骤步骤步骤是：是：是：是：80%80%、90%90%、95%95%、100%100%各种浓度各种浓度各种浓度各种浓度乙醇乙醇乙醇乙醇2 2小时，此过程可用脱水机自控完成。小时，此过程可用脱水机自控完成。小时，此过程可用脱水机自控完成。小时，此过程可用脱水机自控完成。丙酮丙酮丙酮丙酮也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能也是一种脱水能力很强的脱水剂，但因其脱水能力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制

15、作科研、教学切力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切力很强，对组织有剧烈收缩作用，在制作科研、教学切片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温片时一般不用该试剂。但因其沸点低，脱水力强，加温至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检至沸点时在短时间内可脱水彻底，故病理外检快速快速快速快速石蜡石蜡石蜡石蜡切片时可用丙酮脱水剂。切片时可用丙酮脱水剂。切片时可用丙酮

16、脱水剂。切片时可用丙酮脱水剂。乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡乙醇、丙酮等不溶于石蜡，还要经过一个能溶于石蜡的溶剂替代过程，此过程称为的溶剂替代过程，此过程称为的溶剂替代过程，此过程称为的溶剂替代过程，此过程称为透明透明透明透明。常用的透明剂有。常用的透明剂有。常用的透明剂有。常用的透明剂有二二二二甲苯甲苯甲苯甲苯、三氯甲烷、冬青油等。、三氯甲烷、冬青油等。、三氯甲烷、冬青油等。、三氯甲烷、冬青油等。Dehydration脱水透明脱水透明 浸蜡浸蜡浸蜡浸蜡已透明的组织移入已熔化的石蜡中，使

17、蜡充分浸入组织内，已透明的组织移入已熔化的石蜡中，使蜡充分浸入组织内，已透明的组织移入已熔化的石蜡中，使蜡充分浸入组织内，已透明的组织移入已熔化的石蜡中，使蜡充分浸入组织内，此过程称为此过程称为此过程称为此过程称为浸蜡浸蜡浸蜡浸蜡又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点：又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点：又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点：又称透蜡。浸蜡时应注意以下几点：浸蜡熔点浸蜡熔点浸蜡熔点浸蜡熔点：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为：石蜡分为软石蜡与硬石蜡两种，熔点为42425454一般称为软蜡，熔点为一般称为软蜡，熔点为一般称为软

18、蜡，熔点为一般称为软蜡，熔点为56566262称为硬蜡。浸蜡时，称为硬蜡。浸蜡时，称为硬蜡。浸蜡时，称为硬蜡。浸蜡时，应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为应先经软蜡再经硬蜡，（常用的浸蜡熔点为52525454、54545656、56565858级浸蜡），使组织中含有的透明级浸蜡），使组织中含有的透明级浸蜡），使组织中含有的透明级浸蜡），使组织中含有的透明剂完全去尽。剂完全去尽。剂完全去尽。剂完全去尽。浸蜡温度：浸蜡温度：浸蜡温度：浸蜡温度：浸蜡的温度应高于熔点的浸蜡的温度应高于熔点的浸蜡的温度应高于熔点的浸蜡的温度应

19、高于熔点的2 25 5为宜，温度为宜，温度为宜，温度为宜，温度过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将过高可致组织过度收缩或变脆，如在温箱内浸蜡，要将温度控制在温度控制在温度控制在温度控制在60606565的范围。的范围。的范围。的范围。浸蜡时间：浸蜡时间：浸蜡时间：浸蜡时间：可根据组织块的大小及其组织种类而定。可根据组织块的大小及其组织种类而定。可根据组织块的大小及其组织种类而定。可根据组织块的大小及其组织种类而定。30min30min几小时几小时几小时几小时 包埋包埋包埋包埋：将浸蜡后的

20、组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即将浸蜡后的组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即将浸蜡后的组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即将浸蜡后的组织置于融化石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中，称被包在其中，称被包在其中，称被包在其中，称蜡块蜡块蜡块蜡块，此过程称为包埋。包埋用的石蜡，此过程称为包埋。包埋用的石蜡，此过程称为包埋。包埋用的石蜡，此过程称为包埋。包埋用的石蜡和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏和加温的镊子均不能温度过高，防止组织被烫伤，破坏组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织

21、块本身的温度相组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织块本身的温度相组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织块本身的温度相组织结构。包埋用的石蜡温度应与组织块本身的温度相等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。等，如温度不一，可造成组织与周围石蜡脱裂的现象。包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的包埋所用的石蜡要求无杂质，并有一定的粘韧性。蜡的熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组熔点与组织

22、块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组熔点与组织块相适应，过硬的组织（如骨组织、肌肉组织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡织、皮肤等）可用硬度较高的石蜡包埋。包埋用的石蜡可以重复使用，可以重复使用，可以重复使用，可以重复使用，Embedding 包埋包埋切片机切片机石蜡切片机石蜡切片机冰冻切片机冰冻切片机KnifeKnifeMicrotomeArmMicrotomeArmTissueBlockTissueBlockSectionSectio

23、nMicroscopeSlideMicroscopeSlideHowdoesamicrotomework?TissueTissue切片切片on Microtome(wax)on Cryostat(frozen)裱片裱片冰冻切片冰冻切片（frozenfrozensectionsection）是一种在低温）是一种在低温）是一种在低温）是一种在低温条件下使组织快速冷却到条件下使组织快速冷却到条件下使组织快速冷却到条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片一定硬度，然后进行切片一定硬度，然后进行切片一定硬度，然后进行切片的方法：低温恒冷箱冰冻的方法：低温恒冷箱冰冻的方法：低温恒冷箱冰冻的方法：低温恒

24、冷箱冰冻切片法切片法切片法切片法 取材取材取材取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为者难以切完整，最好为者难以切完整，最好为者难以切完整，最好为24242mm24242mm。取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰

25、冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，

26、启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。动旋钮，将组织修平。动旋钮，将组织修平。动旋钮，将组织修平。调好欲切的调好欲切的调好欲切的调好欲切的厚度厚度厚度厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5 510um10um间。间。间。间。调好调好调好调好防卷板防卷板防卷板防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要。制作冰冻切

27、片，关键在于防卷板的调节上，这就要。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这

28、时便可掀起防卷板，取一载玻片，整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。将其附贴上即可。将其附贴上即可。将其附贴上即可。应视不同的组织选择不同的应视不同的组织选择不同的应视不同的组织选择不同的应视不同的组织选择不同的冷冻度冷冻度冷冻度冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主。冷冻箱中冷冻度的高低，主。冷冻箱中冷冻度的高低，主。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组要

29、根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10-10-1515左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15-152020左右，切带脂肪的组织时，应调至左右，切带脂肪的组织时，应调至左右，切带脂

30、肪的组织时，应调至左右，切带脂肪的组织时，应调至-25-25左右，切含大量的左右，切含大量的左右，切含大量的左右，切含大量的脂肪时，应调至脂肪时，应调至脂肪时，应调至脂肪时，应调至-30-30。冰冻切片冰冻切片冰冻切片染色冰冻切片染色 切片固定切片固定切片固定切片固定30303030秒秒秒秒1 1 1 1分钟。分钟。分钟。分钟。水洗。水洗。水洗。水洗。染苏木素染苏木素染苏木素染苏木素3 3 3 35 5 5 5分钟。分钟。分钟。分钟。分化。分化。分化。分化。于碱水中返蓝于碱水中返蓝于碱水中返蓝于碱水中返蓝20202020秒。秒。秒。秒。伊红染色伊红染色伊红染色伊红染色1010101020202

31、020秒。秒。秒。秒。脱水，透明，中性树胶封固。脱水，透明，中性树胶封固。脱水，透明，中性树胶封固。脱水，透明，中性树胶封固。涂片涂片涂片涂片磨片磨片磨片磨片HEHE染色染色苏木精苏木精 Hematoxylin碱性染料碱性染料被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性被苏木精染成蓝色的特性称嗜碱性Basophilic，如：细胞核，核糖体，粗面内如：细胞核，核糖体，粗面内质网等质网等伊红伊红Eosin酸性染料酸性染料被伊红染成红色的特性称嗜酸性被伊红染成红色的特性称嗜酸性Acidophilic如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑如：细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）面内质网）中性或嫌色性中性

32、或嫌色性与两染料的亲和力都不强与两染料的亲和力都不强1 1、取材、取材2 2、固定、固定3 3、漂洗、漂洗4 4、脱水、脱水5 5、透明、透明6 6、透蜡、透蜡7 7、包埋、包埋8 8、修块、修块9 9、切片、切片1010、染色、染色石蜡切片HE染色操作步骤 常规石蜡切片常规石蜡切片常规石蜡切片常规石蜡切片H H H HE E E E染色程序染色程序染色程序染色程序(一一一一)脱蜡至水脱蜡至水脱蜡至水脱蜡至水1 1二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯5-155-15分钟分钟分钟分钟2 2二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯5-155-15分钟分钟分钟分钟3 3无水乙醇无水乙醇无水乙醇无水乙醇33分钟分钟分钟分钟4 4

33、9595酒精酒精酒精酒精33分钟分钟分钟分钟5 58080酒精酒精酒精酒精33分钟分钟分钟分钟6 67070酒精酒精酒精酒精33分钟分钟分钟分钟7 7自来水洗自来水洗自来水洗自来水洗(二二二二)染色染色染色染色1 1HarrisHarris苏木苏木苏木苏木素液素液素液素液 5-7 5-7 5-7 5-7分钟分钟分钟分钟2 2自来水洗自来水洗自来水洗自来水洗55分钟分钟分钟分钟3 31 1盐酸溶液分化盐酸溶液分化盐酸溶液分化盐酸溶液分化3030秒秒秒秒4 4自来水洗自来水洗自来水洗自来水洗55分钟分钟分钟分钟5 51 1氨水返蓝氨水返蓝氨水返蓝氨水返蓝1010秒秒秒秒6 6自来水洗自来水洗自来水

34、洗自来水洗15-2015-20分钟分钟分钟分钟7 79595酒精酒精酒精酒精33分钟分钟分钟分钟8 81 1伊红酒精溶液伊红酒精溶液伊红酒精溶液伊红酒精溶液1-21-2分钟分钟分钟分钟(三三)脱水、透明和封固脱水、透明和封固l l l l95959595酒精酒精酒精酒精2 2 2 2分钟分钟分钟分钟2 2 2 2无水酒精无水酒精无水酒精无水酒精2 2 2 2分钟分钟分钟分钟3 3 3 3无水酒精无水酒精无水酒精无水酒精2 2 2 2分钟分钟分钟分钟4 4 4 4二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯5 5 5 5分钟分钟分钟分钟5 5 5 5二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯5 5 5 5分钟分钟分钟分钟染色染色ma

35、nuallyautomatedHEHE染色染色 注意事项注意事项注意事项注意事项任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。甲

36、苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。在在在在H H H HE E E E染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也该分化脱色的部分末予脱

37、去，或分化不足致染色不均匀，复染对也不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染色的成败除染色技术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛

38、中的组织，由于过术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等均会使染色模糊。均会使染色模糊。均会使染色模糊。均会使染色模糊。伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水

39、一伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一定要彻底，否则，影响透明。定要彻底，否则，影响透明。定要彻底，否则，影响透明。定要彻底，否则，影响透明。脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好能达到良好效果。封片时，中性树

40、胶不能滴加太多或太少。封固好的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中40-5040-5040-5040-50烘烤烘烤烘烤烘烤15151515小时小时小时小时左右，有利于切片的保存。左右，有利于切片的保存。左右，有利于切片的保存。左右，有利于切片的保存。组织化学术组织化学术(histochemistry)(histochemistry)组织化学术组织化学术(histochemistry)(histochemistry)为应用化为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物

41、学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术学的原理和技术,与组织学技术相结合而与组织学技术相结合而产生的技术产生的技术,能在组织切片定性、定位地能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态显示某种物质的存在与否、以及分布状态.还可进一步用显微分光光度计或图象分析还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获获得定量的信息得定量的信息.应用这种技术于游离细胞应用这种技术于游离细胞的样品的样品(如细胞涂片如细胞涂片),),则称细胞化学术则称细胞化学术(cytochemistry).(cytochemistry).一般

42、组织化学术一般组织化学术一般组织化学术一般组织化学术 基本原理是在切片上基本原理是在切片上加某种试剂加某种试剂,和组织中的待检物质发生化和组织中的待检物质发生化学反应学反应,其最终产物或为有色沉淀物其最终产物或为有色沉淀物,以以用光镜观察用光镜观察,或为重金属沉淀或为重金属沉淀,以用电镜以用电镜观察观察.糖类糖类:常用过碘酸希夫反应常用过碘酸希夫反应(periodic(periodic acid Schiff reaction,PAS acid Schiff reaction,PAS 反应反应)显示显示多糖和糖蛋白的糖链多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂糖被强氧化剂.过过碘酸氧化后碘酸氧化后,形

43、成多醛形成多醛;后者再与无色的后者再与无色的品红硫酸复合物品红硫酸复合物(即希夫试剂即希夫试剂)结合结合,形成形成紫红色反应产物紫红色反应产物.PASPASPASPAS反应阳性反应阳性反应阳性反应阳性过碘酸过碘酸SchiffSchiff反应反应(periodicacidSchiffreaction)，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。，是确定组织或细胞中有无多糖存在的一种方法。氧化氧化 Schiff试剂试剂 多糖多糖 醛醛 紫红色沉淀紫红色沉淀脂类脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色,使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用锇酸固定兼染色,脂质呈黑色.核

44、酸核酸:显示显示DNADNA的传统方法为孚尔根反应的传统方法为孚尔根反应(Feulgen reaction).(Feulgen reaction).切片切片先经稀盐酸处理先经稀盐酸处理,使使DNADNA分解分解;再用希夫试剂处理再用希夫试剂处理,形成紫红色反形成紫红色反应物应物.如果同时显示如果同时显示DNADNA和和RNA,RNA,则用甲基绿则用甲基绿-派派若宁反应若宁反应.甲基绿与甲基绿与细胞核细胞核DNADNA结合呈蓝结合呈蓝绿色绿色,派若宁与核仁派若宁与核仁及胞质内的及胞质内的RNARNA结合结合呈红色呈红色.酶类:通过显示酶的催化活性来表明酶的存在.程序是将切片置于含特异性底物的溶液

45、中孵育,底物经酶的作用形成初级反应产物,它再与某种捕捉剂结合,形成显微镜下可见的沉淀物,即最终反应物.例如显示酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液(pH 5.0)中孵育,底物经酶水解,释放磷酸;用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成细微的磷酸铅,亲银性：亲银性：亲银性：亲银性：使硝酸银直接还原而显色使硝酸银直接还原而显色使硝酸银直接还原而显色使硝酸银直接还原而显色嗜银性：嗜银性：嗜银性：嗜银性：加还原剂后才能显色加还原剂后才能显色加还原剂后才能显色加还原剂后才能显色异染性：异染性：异染性：异染性：用甲苯胺蓝等碱性染料染色后不显蓝色而呈紫红色用甲苯胺蓝等碱性染料染色后不显蓝色而呈

46、紫红色用甲苯胺蓝等碱性染料染色后不显蓝色而呈紫红色用甲苯胺蓝等碱性染料染色后不显蓝色而呈紫红色（肥大细胞肥大细胞肥大细胞肥大细胞）免疫细胞（组织）化学免疫细胞（组织）化学抗原抗原（antigen,Ag）与）与抗体抗体（antibody）特异特异结合结合，用已知抗体检测未知抗原的一种方法用已知抗体检测未知抗原的一种方法。对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加对一些特殊的标本需进一步进行处理来增加检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。检测的敏感性和特异性，减少非特异性干扰。1.1.蛋白酶消化法蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞和组织的通透采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，增加细胞

47、和组织的通透性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。性，以利于抗体与抗原最大限度的结合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶等。2.2.非特异吸附法非特异吸附法免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异免疫组化技术中非抗原抗体反应出现的阳性染色成为非特异性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相性染色。防止非特异性染色的有效方法是采用与第二抗体相同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，然后再进行同的动物源血清（非免疫血清）吸附封闭底物，然后再进行抗原抗体结合反应，必要时也可采用抗原抗体结合反应，必要时也可采用2%2%左右的牛

48、或人白蛋白左右的牛或人白蛋白封片，减少非特异性染色。封片，减少非特异性染色。免疫组化染色中标识物的选择免疫组化染色中标识物的选择用量微小，容易在光镜或电镜下识别用量微小，容易在光镜或电镜下识别机体内无同一物质或类似物质机体内无同一物质或类似物质物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结物理或化学性质稳定，可与抗原或抗体结合，其结合物也稳定合，其结合物也稳定目前常用标识物质有目前常用标识物质有荧光色素、放射性荧光色素、放射性同位素、重金属、微粒子、酶同位素、重金属、微粒子、酶等等设立对照实验设立对照实验为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对

49、照、空白对照、自身对照和吸收试验等。（1 1）阳性对照）阳性对照用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。（2）阴性对照用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。免疫组化的结果判断免疫组化的结果判断免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、

50、定量和定位的依据。反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。著区别。几种常用的免疫组化检测技术荧光免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术免疫标记电镜技术免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：1 1、组织材料的处理：、组织材料的处理：常用的固定液为：常用的固定液为：10%10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%4%多聚甲醛