课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (12)(精品).ppt

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1、微生物的培养与应用微生物的培养与应用土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的农业氮肥。尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接不能直接被农被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+CO+CO2 22NH2NH3 3+H+H2 2OO3 3、常见的分解尿素的微生

2、物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：筛选依据启示：筛选依据寻找寻找目的菌种目的菌种时要根据它对时要根据它对生存环境生存环境的要求，到相应的

3、环境中去寻找。的要求，到相应的环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大多数微生物只有多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNADNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一是一是一是一种在体外将种在体外将种在体外将种在体外将少量少量少量少量DNADNADNADNA大量大量大量大量复制复制复制复制的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求使用使用使用使用耐高温（耐高温（耐高温（耐高温（939393930 0 0 0C C C C）的）的）的）的

4、DNADNADNADNA聚合酶。聚合酶。聚合酶。聚合酶。如何寻找这种耐高温的酶呢？如何寻找这种耐高温的酶呢？（一）筛选菌株（一）筛选菌株要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、培养条件等；养、生理、培养条件等；养、生理、培养条件等；养、生理、培养条件等；方法：方法：方法：方法：抑制大多数微生物不能生长（加入某些化学物质）抑制大多数微生物不能生长（加入某些化学物质）抑制大多数微生物不能生长（加入某些化学物质）抑制大多数微生物不能生长（加

5、入某些化学物质）造成有利于该菌生长的环境（营养成分、培养条件）造成有利于该菌生长的环境（营养成分、培养条件）造成有利于该菌生长的环境（营养成分、培养条件）造成有利于该菌生长的环境（营养成分、培养条件）结果：结果：结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。释等方法对它进行纯化培养分离。释等方法对它进行纯化培养分离。释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于人

6、为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件生长的条件生长的条件(包括营养、温包括营养、温包括营养、温包括营养、温度、度、度、度、pHpH等等等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基选择培养基选择培养基选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH

7、2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁生物由于不能分解尿素，缺乏

8、氮源而不能生长繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理该培养基对微生物有选择作用吗？该培养基对微生物有选择作用吗？1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小

9、的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点2.2.活菌计数法活菌计数法稀释涂布平板法稀释涂布平板法原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落基上所形成的一个菌落一般一般是由一个单细胞繁殖是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的

10、稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在30303030300300300300的的的的平板上进行计数。平板上进行计数。平板上进行计数。平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个同一稀释度加到三个或三个同一稀释度加到三个或三个同一稀释度加到三个或三个以上的平板中以上的平板中以上的平板中以上的平板中，经涂布

11、，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低统计的菌落往往比活菌的实际数目低。（为什么）。（为什么）。（为什么）。（为什么）涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50505050个左右为个左右为

12、个左右为个左右为最好。最好。最好。最好。说说明明设设置置重重复复组组的的重重要要性性。第第一一位位同同学学只只涂涂布布了了一一个个平平板板，没没有有设设置置重重复复组组，因因此此结结果果不不具具有有说说服服力力。第第二二位位同同学学考考虑虑到到设设置置重重复复组组的的问问题题，涂涂布布了了3 3个个平平板板，但但是是，其其中中1 1个个平平板板的的计计数数结结果果与与另另2 2个个相相差差太太远远，说说明明在在操操作作过过程程中中可可能能出出现现了了错错误误，因因此此，不不能能简简单单地地将将3 3个个平平板板的的计计数数值值用用来来求求平平均均值值。这这个个实实例例启启示示学学生生，在在设设

13、计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。计数法计数法显微镜直接计数法、显微镜直接计数法、稀释涂布平板法、稀释涂布平板法、例题：统计菌落数目的方法有例题：统计菌落数目的方法有 （）A.B.A.B.C.D.C.D.DD涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接计数法直接计数法 生理指标法生理指标法设置

14、对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基倍稀释的培养基中筛选出大约中筛选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约的稀释度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原原因因：土土样样不不同同，培培养养基基污污染染或或操操作

15、作失失误误(或或者是混入了其他的含氮物质者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果

16、结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基以及牛肉选择培养基以及牛肉膏蛋白胨培养基膏蛋白胨培养基。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应

17、在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板 三三 样品的稀释样品的稀释为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤

18、壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/g/g）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌菌数约为数约为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针

19、针对对性性地地提提供选择培养的条件。供选择培养的条件。.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在30303030300300300300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，

20、并能够进行菌落的计数，如果果果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物

21、往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察操作提示操作提示 一一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形瓶中，塞好棉塞。形瓶中，塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中

22、，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间三三.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，对照的培养皿在培养过程中没通过对照实验，对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染；牛肉有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染；牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的菌落数，说明选择培养基筛选出一些菌落的菌落数，说

23、明选择培养基筛选出一些菌落2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030300300个菌落的稀个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。表示实验不精确。四四.课外延伸课外延伸鉴定培养基鉴定培养基 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将升高，指示剂将变红变红，说明该细菌能够，说明该细菌能够分解尿素。分解尿素。测定饮

24、水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养培养培养培养基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌基上培养，大肠杆菌菌落呈现带有金属光泽的深紫菌落呈现带有金属光泽的深紫菌落呈现带有金属光泽的深紫菌落呈现带有金属光泽的深紫色色色色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，

25、通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑紫色中心黑紫色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝伊红美蓝琼脂琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本课题知识小结本课题知识小结:1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养

26、细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的Taq

27、DNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C