分子生物学ppt课件：基因敲除.ppt

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1、基因的生物学功能鉴定基因的生物学功能鉴定技术技术 复旦大学复旦大学复旦大学第一节第一节 转基因技术转基因技术第二节第二节 基因敲除技术基因敲除技术第三节第三节 RNA 干涉干涉 基因功能的鉴定技术基因敲除基因敲除 (gene knock-out)基基因因敲敲除除 (gene knock-out)属属于于基基因因打打靶靶技技术术的的一一种种，利利用用同同源源重重组组的的原原理理，在在ES细细胞胞中中定定点点破破坏坏内内源源基基因因，然然后后利利用用ES细细胞胞发发育育的的全全能能性性，获获得得带带有有预预订订基基因因缺缺陷陷的的杂杂合子合子，通过，通过遗传育种遗传育种最终获得目的基因缺陷的最终获

2、得目的基因缺陷的纯合个体纯合个体。1.概念*（*为教学重点）美国犹他大学Eccles人类遗传学研究所马里奥卡佩奇MarioR.Capecchi英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院马丁埃文斯MartinJ.Evans美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院奥利弗史密斯OliverSmithies基因敲除技术发展及成果1989年成功对年成功对一只老鼠进行一只老鼠进行基因打靶基因打靶 TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies2 2.基本原理基本原理利用利用DNA同源重组的原理，在活

3、体内将特定基因从染色体同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体上剔除的过程。上剔除的过程。Genomic DNA:Targeting DNA fragment:Genomic DNA/gene knocked out:Lost its original functionHomologous arm sequence3 3.操作流程操作流程 *将基因敲除载体导入将基因敲除载体导入ESES细胞细胞：重组置换重组置换用选择培养基筛选已击中的细胞将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物（缺失的杂合子小鼠）。构建基因构建基因敲除载体敲除载体通过杂合子后代交配，获得纯合子基因敲除小鼠；通过杂合子后代交配

4、，获得纯合子基因敲除小鼠；对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。1.构建基因构建基因敲除载体敲除载体基因敲除载体的特点：基因敲除载体的特点：待敲除基因的同源臂序列待敲除基因的同源臂序列阳性筛选标记基因阳性筛选标记基因（NeoR)阴性筛选标记基因阴性筛选标记基因 (TK(TK gene)gene)PTargeting vector打靶载体打靶载体问题：如何构建打靶载体？问题：如何构建打靶载体？Positive screening marker geneHomologous armsHSV-Tk geneNeoRestriction enzyme打靶载体打靶载体PTargeting vecto

5、r Linearize the targeting vector Homologous arms of gene waiting for being knocked outNegative screening marker gene:TK geneNeoR*HSV-TK 基因敲除载体的构建过程：基因敲除载体的构建过程：待敲除基因PCloningvectorPRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorNeoRgenePRecombinantcloningvectorPRecombinantcloningvectorTkgenePTarget

6、ingvector将待敲除基将待敲除基因切除大部因切除大部分使其失活，分使其失活，留下用于重留下用于重组的同源臂组的同源臂同源序列中间插同源序列中间插入了入了NeoR基因基因构建打靶载体构建打靶载体在同源臂的外在同源臂的外侧线性化载体侧线性化载体ES cellES cellPTargeting Targeting vectorvectorRestriction Restriction enzymeenzymeHomologous armsHomologous armsHSV-TkHSV-TkNeoNeo如何筛选出同源重组的ES 细胞呢？2.2.将基因敲除载体导入将基因敲除载体导入ESES细胞细

7、胞：重组置换重组置换小鼠受精卵发育第小鼠受精卵发育第小鼠受精卵发育第小鼠受精卵发育第3 35 5天（分裂至天（分裂至天（分裂至天（分裂至8 8 个细胞左右）时个细胞左右）时个细胞左右）时个细胞左右）时的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。的胚泡细胞；能在体外培养，具有发育的全能性。ESES细胞中同源重组的示意图细胞中同源重组的示意图同源重组在哺乳动物细胞中发生的概率（10-5），一个合适的筛选方法对于减小工作量是十分必要的。如何筛选出同源重组的ES 细胞呢？PTargeting vector打靶载体打

8、靶载体NeoR阳性筛选标记基因（NeoR)抗新霉素抗药基因。G418是一种和新霉素结构相似的抗生素。G418可以筛选所有能表达neo基因的细胞。阴性筛选标记基因 (TK gene)HSV-TK基因的表达产物是胸苷激酶，此酶能分解单核苷酸类似物，并且分解产物是有毒性的。普通细胞因无TK 基因，可在含单核苷酸类似物的培养基中生长。如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡HSV-TK正负筛选系统筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？1.同源重组HSV-Tk HSV-Tk Neo Neo EScellsP53 geneP53 gene正负筛选系统工

9、作原理P53 geneP53 gene10-5-10-6Neo geneNeo geneNeor基因进入ES细胞的基因组P53基因被替换在G418、单核苷酸类似物的培养基中，可以存活。2.随机插入，非同源重组P53 geneP53 geneNeo geneNeo geneHSV-TkHSV-TkP53 geneP53 geneNeor基因和HSV-TK基因同时进入ES细胞的基因组在G418培养基中存活，但是含有单核苷酸类似物培养基中死亡。P53基因没有被替换Positive-negativeselectionHomologous recombinantsG418Neomycin(positiv

10、e selection)kills the non-insertions;Gancyclovir(negative selection)kills the random insertionsIn survival cells,P53 gene is replaced by Neo.MediumwithG418&GancyclovirNormalEScellsTransfection3.利用利用ES细胞发育的全能性，细胞发育的全能性，将一条染色体上特定基将一条染色体上特定基因失活的因失活的ES细胞细胞发育成特定基因敲除的小鼠。发育成特定基因敲除的小鼠。?A.A.基因敲除基因敲除ESES细胞注射入

11、胚泡细胞注射入胚泡B.B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中C.C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠D.D.杂合子小鼠交配，杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠获得基因敲除的纯合子小鼠3 3A.A.基因敲除的基因敲除的ESES细胞被注射入胚泡。细胞被注射入胚泡。Mate 3 days.Provides Mate 3 days.Provides the blastocyst the blastocyst with with normal ES cellnormal ES cellInjectChimericBlastocystoriginal

12、innercellmassNormalMouseembryo嵌合胚泡3 3B.B.嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合胚泡植入假孕小鼠子宫中嵌合体小鼠嵌合体小鼠一些器官有些细胞来自于囊胚，有些来自于ES,就会产生嵌合现象。皮肤细胞：囊胚（黄色），ES（黑色）黑细胞和黄细胞之间的基因组在任何单个细胞内并没有交集嵌合体小鼠带着两套完全不同的基因组。3C.3C.嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠嵌合体小鼠的繁育，获得杂合子小鼠Mate Mate 正常小鼠正常小鼠嵌合体小鼠嵌合体小鼠杂合子小鼠杂合子小鼠杂合子小鼠：杂合子小鼠：一条染色体一条染色体P53P53基因突变；另一基因突变；另一条染色上基因是野生型的。

13、条染色上基因是野生型的。正常小鼠正常小鼠1 12 Heterozygous mice2 Heterozygous mice如果嵌合体小鼠的生殖细胞是由基因敲除的如果嵌合体小鼠的生殖细胞是由基因敲除的ES细胞发育成的。细胞发育成的。所有细胞都是3D.3D.杂合子小鼠交配，杂合子小鼠交配，获得基因敲除的纯合子小鼠获得基因敲除的纯合子小鼠Mate Mate 1 14 4 纯合子基因敲除小鼠纯合子基因敲除小鼠小结：基因敲除的操作流程*嵌合体杂合子小鼠杂合子小鼠基因敲除的纯合子小鼠与阴性小鼠交配123A3B3C3D 上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活，上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失

14、活，但基因组中引入了一个外源标记的基因（但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR),),该基因该基因会影响机体正常的功能。怎么改进？会影响机体正常的功能。怎么改进？扩展知识：有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体,针对这针对这类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？条件性基因敲除条件性基因敲除*将某个基因修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某将某个基因修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段

15、的一种特殊的基因敲除方法。一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用实际上是在常规的基因敲除的基础上，利用重组酶重组酶Cre介导介导的位点特异性的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围时空范围上设上设置一个可调控的置一个可调控的“按钮按钮”，从而使对小鼠基因组，从而使对小鼠基因组的修饰的范的修饰的范围和时间处于一种可控状态围和时间处于一种可控状态。条件性基因敲除条件性基因敲除Cre/loxp系统系统利用可利用可诱导性启动子诱导性启动子和和Cre重组酶重组酶特异特异性识别位点构建基因性识别位点构建基因敲除载体，通过诱导剂实现可控

16、性基因敲除。敲除载体，通过诱导剂实现可控性基因敲除。两个要素：两个要素：Cre重组酶重组酶诱导型启动子诱导型启动子一种一种343343个氨基酸组成的单体个氨基酸组成的单体蛋白质，属于位点特异性重蛋白质，属于位点特异性重组酶。组酶。从噬菌体从噬菌体P1提取获得。提取获得。特异性识别特异性识别loxp序列序列，可以引发可以引发loxPloxP位点的位点的DNA DNA 重组。重组。一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点。Cre重组酶重组酶和和loxp序列序列13bp13bp13bp13bp8 8b

17、pbp这这8bp8bp的序列决定的序列决定LoxpLoxp位点的方向位点的方向Cre Cre 结合位点结合位点Cre Cre 结合位点结合位点 核心序列核心序列Cre重组酶介导的重组方式重组酶介导的重组方式1.1.回顾一下同源序列同源重组回顾一下同源序列同源重组LoxpLoxp是一段是一段34bp34bp长的回文序列，在两段反向重复的长的回文序列，在两段反向重复的13bp13bp片段之间有片段之间有8bp8bp的间隔序列，这的间隔序列，这8bp8bp的序列决定的序列决定LoxpLoxp位点的方向。位点的方向。TATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATAATAACTT

18、CGTATA GCATACAT TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT方向一致TATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA GCATACAT TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT CGTATGTA ATATGCTTCAATAATAACTTGCTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT同源重组Cre重组酶介导的重组方式重组酶介导的重组方式Cre重组酶重组酶和和loxp序列序列Cre/L

19、oxP重组系统：重组系统：-特定阶段敲除特定阶段敲除基本策略：基本策略：使待敲除基因位于两个使待敲除基因位于两个LoxPLoxP位点之间位点之间。loxPloxP位点被引入到相应基因的内含子内，胚胎发育期间不会位点被引入到相应基因的内含子内，胚胎发育期间不会影响相应基因的功能。特定阶段：影响相应基因的功能。特定阶段：Cre 酶切割靶基因。酶切割靶基因。Cre/LoxP重组系统基因敲除的原理重组系统基因敲除的原理*基本策略：基本策略：使待敲除基因位于两个使待敲除基因位于两个LoxPLoxP位点之间位点之间CreCre重组酶的可控性表达重组酶的可控性表达采用胚胎干细胞技术获得转基因小鼠采用胚胎干细

20、胞技术获得转基因小鼠（1 1）转基因表达载体的构建转基因表达载体的构建 在体外在体外构建构建一个在一个在目的基因两端分别含有一个目的基因两端分别含有一个loxPloxP位点位点的基因敲除载的基因敲除载体体（2 2）将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞）将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞 基因敲除载体通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。基因敲除载体通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。（3 3）将转基因将转基因ES细胞或受精卵细胞移植胚泡中，将转基因胚泡移植入假孕细胞或受精卵细胞移植胚泡中，将转基因胚泡移植入假孕小鼠的子宫腔中小鼠的子宫腔中（4 4）鉴定并筛选转基因小鼠）

21、鉴定并筛选转基因小鼠1.1.如何构建靶基因被两个如何构建靶基因被两个LoxPLoxP位点锚定的转基因位点锚定的转基因小鼠小鼠（1）条件性基因敲除载体的构建基因敲基因敲除载体的结构是：除载体的结构是：4NeoLoxPLoxPLoxPTK如果基因组序列是：如果基因组序列是：1234待敲除基因1.1.如何构建靶基因被两个如何构建靶基因被两个LoxPLoxP位点锚定的转基因位点锚定的转基因小鼠小鼠基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除12344NeoLoxPLoxPLoxPTK1234NeoLoxPLoxPLoxPHomologous recombinationGeno

22、mic DNA:使待敲除基因位于两个使待敲除基因位于两个LoxPLoxP位点之间位点之间使待敲除基因位于两个使待敲除基因位于两个LoxPLoxP位点之间位点之间基本流程：条件性基因敲除载体的构建在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除在ES细胞中敲除Neo基因1234NeoLoxPLoxPLoxPCre expression gene was transiently introduced into targeted ES cellsCre1234LoxPLoxP左右左右LoxpLoxp突变体突变体(Lox71/Lo(Lox71/Lox66)x66)靶基因被两个靶基因被两个LoxPLoxP位点锚定的

23、转基因小鼠位点锚定的转基因小鼠靶基因被两个靶基因被两个LoxPLoxP位点锚定的转基因小鼠位点锚定的转基因小鼠,称为称为loxploxp floxedfloxed 小鼠。小鼠。“loxP floxed”loxP floxed”小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一小鼠，虽然靶基因的两侧已各装上了一个个loxPloxP，但靶基因并没有发生其他的变化，但靶基因并没有发生其他的变化，“loxp”小小鼠表型仍同野生型的一样。鼠表型仍同野生型的一样。靶基因的修饰靶基因的修饰(切除切除)是以是以Cre Cre 的表达为前提的。的表达为前提的。只要控制只要控制Cre Cre 的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠

24、中的表达特异性和表达水平就可实现对小鼠中靶基因修饰的特异性和程度。靶基因修饰的特异性和程度。2 2.如何构建如何构建CreCre重组酶的转基因小鼠重组酶的转基因小鼠CreCre重组酶的可控性表达重组酶的可控性表达第二只小鼠采用胚胎干细胞技术获得。第二只小鼠采用胚胎干细胞技术获得。在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。在这种小鼠的体内，Cre重组酶可在特定组织内进行可控性表达。Cre重组酶的可控性表达使使Cre 基因位于可诱导性启动子下游：基因位于可诱导性启动子下游：TRECreinducerON红色的半圆圈为：四环素阻遏蛋白（TetR）圆圈：

25、_诱导剂：四环素当四环素存在时，TetR构象发生改变，基因表达Cre重组酶的可控性表达构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统 使使Cre 基因位基因位于可诱导性启于可诱导性启动子下游：动子下游：TRECreCreinducerONCreCreCre1234LoxPLoxPCreCreCreCre123LoxP利用控制Cre 表达的启动子的活性，通过对诱导剂给予时间的控制。从而在1oxP 动物的一定发育阶段实现对特定基因进行遗传修饰。构建可诱导性表达-组织特异性基因敲除系统 Cre重组酶的可控性表达rtetRTissue-specific promoterrtetRtetTRECreON123

26、4LoxPLoxPCreCreCreCreTeT阻遏蛋白四环四环素开素开关系关系统统 lck启动子(胸腺细胞)、alphaA晶状体球蛋白启动子(眼晶状体)、钙调素依赖性激酶启动子(海马和大脑新皮质)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、乳清酸性蛋白启动子(乳腺)、aP2启动子(脂肪组织)、AQP2启动子(肾脏集合管)和肌浆蛋白启动子(骨骼肌)等。在何种组织细胞或器官中敲除某一特定的基因取决于所选择的启动子。启动子受某些外源性化学物质的调控，外源性调控的基因敲除可以避免在胚胎发育早期由于基因功能的异常所产生的副作用。只要选择合适的启动子调控Cre重组酶的表达，使其在生物体特定的部位、特定的条件下产生，就

27、可以实现相应条件下某一特定基因的敲除。细胞类型特异的启动子细胞类型特异的启动子Cre/LoxP重组系统基因敲除重组系统基因敲除*目的基因目的基因在特定组在特定组织敲除织敲除目的基因在目的基因在其他组织正其他组织正常表达常表达构建转基因小鼠产生双基因小鼠条件性基因敲除条件性基因敲除:在在ES细胞上：细胞上：基因敲除基因敲除(目的基因的替换及目的基因的替换及Neo基因敲除基因敲除)转基因转基因(Cre基因的稳定转染基因的稳定转染)在载体构建上：在载体构建上：打靶载体打靶载体(同源臂内侧是同源臂内侧是LoxP目的基因目的基因LoxP)转基因载体转基因载体(可诱导可诱导启动子启动子下游是下游是Cre基

28、因基因)细胞特异性细胞特异性组织特异性组织特异性基因敲除小鼠工程基因敲除小鼠工程2006年，年，美国美国NIH推出推出knockout Mouse Project(KOMP)将系将系统统敲除或破坏小鼠的敲除或破坏小鼠的2万个基因万个基因计计划投入划投入5200万美元建立小鼠基因万美元建立小鼠基因组组突突变变基因数据基因数据库库此此计计划将与加拿大划将与加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project(NorCOMM)及及European Conditional Mouse Mutagenesis Program(EUCOMM)合作，

29、以避免重复工作合作，以避免重复工作相关技术：1.基因敲除(geneknock-out)2.条件性基因敲除(conditionalgeneknock-out)3.TALEN4.CRISPER/Cas9失活或抑制生物体内原有基因（DNA水平）Cas9 is the nuclease guided by the crRNA and tracrRNA to cleave specific DNA sequences.(Deltcheva et al.2011)Summary:基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过基因功能研究一般是在活细胞或生物体内、通过观察基因的终产物而实现的观察基因的终产物而实

30、现的基本策略：基本策略：在原有基因组的基础的增加外源基因在原有基因组的基础的增加外源基因 (transgenic technique)将基因组上原有的基因剔除将基因组上原有的基因剔除 (Gene targeting:knock-out,knock-in)封闭基因一级产物减少蛋白翻译的模板封闭基因一级产物减少蛋白翻译的模板 (RNAi,反义反义RNA)小结小结第一节第一节 转基因技术转基因技术第二节第二节 基因敲除技术基因敲除技术【第一节第一节 转基因技术转基因技术 重点内容重点内容】1、定义 *转基因技术（转基因技术（transgenic technologytransgenic techno

31、logy）是指将外源基是指将外源基因导入因导入受精卵受精卵或或胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonic stem cellembryonic stem cell，即，即ESES细细胞），通过胞），通过随机重组随机重组使外源基因插入细胞染色体使外源基因插入细胞染色体DNADNA。随后将受精卵或随后将受精卵或ESES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得细胞植入假孕受体动物的子宫，使得转基因细胞发育成转基因细胞发育成携带外源基因携带外源基因，并能，并能稳定遗传稳定遗传的动物的动物。转基因动物（转基因动物（transgenic animaltransgenic animal）指应用转基因技术培指应用转基因

32、技术培育出的育出的携带外源基因携带外源基因，并能，并能稳定遗传稳定遗传的动物。的动物。转基因小鼠最为转基因小鼠最为常见。常见。*2、基本流程 *转基因载体的构建转基因载体的构建将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞。将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞。将转基因将转基因ES细胞移植胚泡中细胞移植胚泡中将转基因胚泡或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫将转基因胚泡或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中腔中鉴定并筛选转基因小鼠鉴定并筛选转基因小鼠【第二节第二节 基因敲除基因敲除技术技术 重点内容重点内容】基基因因敲敲除除 (gene knock-out)属属于于基基因因打打靶靶技技术术的的一一种种，利利用用同同

33、源源重重组组的的原原理理，在在ES细细胞胞中中定定点点破破坏坏内内源源基基因因，然然后后利利用用ES细细胞胞发发育育的的全全能能性性，获获得得带带有有预预订订基基因因缺缺陷陷的的杂杂合子合子，通过，通过遗传育种遗传育种最终获得目的基因缺陷的最终获得目的基因缺陷的纯合个体纯合个体。1.概念*2.2.操作流程操作流程 *将一条染色体上特定基因失活的将一条染色体上特定基因失活的ES细胞细胞发育成特定基因发育成特定基因 缺失的杂合子小鼠。缺失的杂合子小鼠。构建基因构建基因敲除载体敲除载体通过杂合子后代交配，获得纯合子基因敲除小鼠。通过杂合子后代交配，获得纯合子基因敲除小鼠。将基因敲除载体导入将基因敲除

34、载体导入ESES细胞细胞：重组置换重组置换如何构建打靶载体？如何利用阳性和阴性筛选系统筛查重组的胚胎干细胞？3 3.条件性基因敲除条件性基因敲除 *概念Cre/loxp 重组系统基因敲除原理5.反义反义RNA(anti-sense RNA)定义：定义：与与mRNAmRNA互补的互补的RNARNA链，称作反义链，称作反义 RNARNA。用途：用途：封闭特定封闭特定mRNAmRNA的翻译，从而使基因失活的翻译，从而使基因失活。实例：实例：BCL-2 癌基因的anti-sense oligonucleotide，通过与细胞内mRNA互补，封闭该基因的表达，从而治疗 B 淋巴瘤。1995年，康奈尔大学

35、Su博士的实验：用反义RNA(anti-senseRNA)转染线虫可以阻断par-1基因的表达；惊讶地发现：在正义RNA(senseRNA)的对照组中没出现预期的增强基因表达的现象，却出现了基因表达受抑现象。有趣的实验现象有趣的实验现象客观地呈现这一现象客观地呈现这一现象Why？这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反，他们一直没能给这个意想不到的结果作出合理解释。1998年:Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：Andrew Z.FireStanford University School of Medicine Craig C.MelloUniversity of Massachus

36、etts Medical School 用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！将双链RNA给线虫注射，出现了高效、特异性的基因抑制效应。解释：SuGuo博士在转染正义RNA时污染了微量反义RNA，“十分错误”地将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。双链RNA比单链RNA的基因抑制现象的要高效的多。将dsRNA去除后，再将正义的ssRNA注入线虫卵中，没有产生基因沉默现象。将正义及反义ssRNA混合，经退火复性后得到的dsRNA注人线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象，印证了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的结论。1999年：Hunter等的实验进一步验证了RNAi

37、的存在。他们将这种由双链他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干涉（干涉（RNAi）。Fire,A.et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature 391,806-811.(1998)美国科学家安德鲁法尔(左)和克雷格梅洛(右)：发现了干扰机制。Andrew Z.FireStanford University School of Medicine Craig C.MelloUniversi

38、ty of Massachusetts Medical School（一）（一）概念概念（二）（二）发生机制发生机制（三）（三）两种常用策略两种常用策略（四）（四）存在的问题存在的问题（五）（五）应用应用6.RNA干涉干涉(RNA interference)n1.RNAi 技术的概念利用双链RNA 介导同源序列的mRNA 特异性降解，导致的转录后基因沉默。n2.RNAi技术的作用机制Dicer负责识别并切割dsRNARNase 家族中成员家族中成员识别、降解双链识别、降解双链RNA产生约产生约2123nt bp片段片段每个片段每个片段3 端有端有2个碱基突出个碱基突出橙色：解旋酶橙色：解旋酶绿

39、色：内切酶绿色：内切酶灰色：外切酶灰色：外切酶细胞中存在的一种细胞中存在的一种RNARNA诱导的沉默复合体诱导的沉默复合体(RNA-induced RNA-induced silencing complex,silencing complex,RISC)RISC)(由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNAmRNA进行识别和切割进行识别和切割）n2.RNAi技术的作用机制 RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为activated RISC。Activated RISC与靶mRNA互补结合，利用自身核酸内切酶活性将mR

40、NA切断、降解。细胞内的异常dsRNA 被Dicer 酶特异识别、切割成长2123nt的短双链RNA，称为小干扰性RNA(small interfering RNA,siRNA)。siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RISC)。nRNA干扰的作用机制（2个阶段)*起起始始阶阶段段效效应应阶阶段段确定目的基因，确定目的基因，设计设计 siRNA 序列序列A.化学合成或体外转录化学合成或体外转录在体外获得在体外获得 siRNAB.构建构建shRNA表达载体表达载体转染细胞转染细胞转染细胞转染细胞在细胞内产生在细胞内产生SiRNARNAi 效果检测效果检测n3.

41、RNAi 技术的两种常用策略siRNA的化学合成的化学合成 按照设计的序列分别合成两条反向互补的单链RNA 然后等比例混合退火即可。siRNA:5-CGAUUGACAGCGGAUUGCCUU-3 3-UUGCUAACUGUCGCCUAACGG-5 Sense RNA:5-CGAUUGACAGCGGAUUGCCUU-3Antisense RNA:5-GGCAAUCCGCUGUCAAUCGUU-3nA.在体外获得 siRNA 途径SiRNAATargetingmRNA cleavagesuppressionSiRNASiRNA特点：将体外获得的 siRNA 转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高

42、的基因表达抑制效应。大部分RNAi实验可以在此期间获得结果。优点：无需构建载体，节省时间。缺点：（1）效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度，无法长期保存转染细胞！（2）转染效率无法保证！nA.在体外获得 siRNA 途径nB.采用 shRNA 表达载体途径 shRNA 表达载体的表达框架表达载体的表达框架包括：一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA编码序列，一个RNA pol III 终止位点。PromoterterminatorSense sequenceAnti-sense sequenceloopRNApol启动子(U6)可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。shRNA

43、构建构建shRNA表达载体表达载体UU35LoopSense strandAntisense strand19 nt将重组质粒转染将重组质粒转染细胞，在细胞内细胞，在细胞内转录持续产生发转录持续产生发夹夹shRNAnB.采用 shRNA 表达载体途径 shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA）策略：利用 shRNA 表达质粒，质粒中含有编码正义和反义siRNA序列的DNA序列在细胞中转录出单链RNA，转录物随即形成发夹结构，中间有约9bp的不配对的序列，即为shRNA。shRNA 被Dicer 加工成siRNA，导致RNAi 的发生。nB.采用 shRNA 表达载体途径通过

44、转染shRNA表达载体，可以长期地抑制基因表达。在长效 RNAi 实验（特别是体内试验）时，只能选择 shRNA 表达载体方法。优点：nB.采用 shRNA 表达载体途径小结：RNAi 实验的两种策略UUSiRNADicer RNase III(1)TransfectionA(2)(3)TargetingmRNA cleavagesuppressionSiRNA(4)SiRNABSummary比较项目化学合成siRNA表达载体材料需求21-merRNAoligos(一对)55-60-merDNAoligos(一对)制备的难易简单、快速需要制备重组载体该方法可在胞内持续产生siRNA，适用于长期

45、研究;在体内试验时，只能选择 该方法。将siRNA 转染到细胞内：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应。效应期的长短取决于细胞的增殖速度无法长期保存转染细胞转染效率无法保证！效应期的长短费用高中等可否进行标记可以不可以4.RNAi技术技术存在存在的问题（的问题（1）siRNA复合物除了预期的靶点，还能潜在地靶向多个基因。这个现象即“脱靶效应(off-targeting)*”。问：你所设计的问：你所设计的RNAi，会不会干涉其它基因的翻译？，会不会干涉其它基因的翻译？siRNA的Off-targeting 的定义及其产生原因问：问：RNAi为什么可能存在在脱靶为什么可能存在在脱靶(off

46、-targeting)效应？效应？正义链与RISC结合解决办法：链偏好性（Strand bias）*使RISC只结合SiRNA的反义链。RNAi 技术还需进行不断的完善！siRNA并不能接近所有与其同源的mRNA分子，有些mRNA序列位于RNA的二级结构中，或与蛋白质形成紧密的复合物，碍阻了siRNA 对靶序列的识别。因此，往往要经过不断的摸索才能选择出最佳的靶序列。目前虽然可将siRNA 高效地导入体外培养的细胞。但，如何高效地、靶向性地导入动物体内特定组织，还是一个急需解决的问题！4.RNAi技术存在的问题（2）（1）研究基因的功能）研究基因的功能 5.RNAi 技术的应用高效率易于操做可

47、实现多种基因突变RNAi(knockdown)VS knockoutRNAi 技术的优点：利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。肿瘤细胞肿瘤细胞（2）基因治疗的新策略A.肿瘤治疗：由于单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi技术能同时特异性阻断多个癌基因的表达。如何设计实验？如何设计实验？1.Dicer 1.Dicer 功能功能2.SiRNA 2.SiRNA 的选择的选择3.3.在体内研究功能在体内研究功能Suppressionofheatshockprotein27induceslong-termdormancyinhumanb

48、reastcancer抑制HSP27,会诱导人乳腺癌长期休眠-ProcNatlAcadSciUSA.2012May29;基因功能研究的实例基因功能研究的实例 Human breast cancer cell line (MDA-MB-436)Angiogenic cell variantNon-angiogenic cell variantThe researchers established an experimental model for the study of human tumor angiogenesis and dormancy.Develop into big TumorRe

49、main dormant without progression into detectable diseaseHumanbreastcancercellline(MDA-MB-436)AngiogeniccellvariantNon-angiogeniccellvariantWesternblotanalysisResult1.Heatshockprotein27(HSP27)ishighlyup-regulatedinangiogenicbreastcancercells,comparedwithnonangiogeniccells.Comparedwiththeoriginalcelll

50、ine,expressionofHSP27proteinwas20%lowerinHSP27KD-1cells,70%lowerinHSP27KD-2cells,84%lowerinHSP27KD-3cells.AngiogenicbreastcancercellsweretransducedwithlentivirusesencodingthreedifferentshRNAsagainstHSP27(HSP27KD-1,HSP27KD-2,andHSP27KD-3).Result2.AngiogenicbreastcancercellsHSP27-RNAi具有促血管新生作用的人乳腺癌细胞接