生检电泳酶幻灯片.ppt

《生检电泳酶幻灯片.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生检电泳酶幻灯片.ppt（32页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、生检电泳酶1第1页，共32页，编辑于2022年，星期一 利用电泳现象对物质进行分利用电泳现象对物质进行分离的技术称为离的技术称为电泳技术电泳技术。电泳技术电泳技术2第2页，共32页，编辑于2022年，星期一 电泳迁移率电泳迁移率是反映带电粒子在单是反映带电粒子在单位电场强度作用下的移动速度。位电场强度作用下的移动速度。即带电粒子在每厘米降为即带电粒子在每厘米降为1 1伏特伏特（V/cmV/cm）的电场强度下每秒钟内移动）的电场强度下每秒钟内移动的厘米数（的厘米数（cm/scm/s）。）。3第3页，共32页，编辑于2022年，星期一=V/E=(1/t)/E=1/tEn为电泳迁移率，为电泳迁移率，

2、nV V为粒子移动的速度（为粒子移动的速度（cm/scm/s），即），即1/t1/tnE E为电场强度（为电场强度（V/cmV/cm）nT T为时间（秒）为时间（秒）n1 1为移动的距离（为移动的距离（cmcm）n为蛋白质电泳的特征常数为蛋白质电泳的特征常数n的单位为的单位为cmcms sv v4第4页，共32页，编辑于2022年，星期一 电泳速度（电泳速度（V V）与其电量（）与其电量（Q Q）和电）和电场强度成正比，而与粒子的半径（场强度成正比，而与粒子的半径（r r）和介质粘度（和介质粘度（）成反比，即）成反比，即 V=V=（QE/6rQE/6r）/E/E这样这样 =V/E=Q/6r=V

3、/E=Q/6r根据根据StokeStoke定律定律5第5页，共32页，编辑于2022年，星期一人血清蛋白的等电点和电泳迁移率人血清蛋白的等电点和电泳迁移率 蛋白质蛋白质 等电点等电点 电泳迁移率电泳迁移率cm2.s-1.v-1 白蛋白白蛋白 4.84 5.910-5 球蛋白球蛋白 5.06 5.110-5 球蛋白球蛋白 5.06 4.110-5 球蛋白球蛋白 5.12 2.810-5 球蛋白球蛋白 6.857.30 1.010-5 第6页，共32页，编辑于2022年，星期一1 1、根据被分离的样品多少分为、根据被分离的样品多少分为 分析电泳分析电泳 制备电泳制备电泳2 2、根据电泳时电压的高低

4、分为、根据电泳时电压的高低分为 高压电泳高压电泳 常压电泳常压电泳电泳的分类电泳的分类7第7页，共32页，编辑于2022年，星期一3 3、根据是否使用支持物分为、根据是否使用支持物分为 自由电泳自由电泳 区带电泳区带电泳4 4、根据电泳系统是否均一分为、根据电泳系统是否均一分为 连续电泳连续电泳 不连续电泳不连续电泳8第8页，共32页，编辑于2022年，星期一 电电 泳泳 仪仪 由由直流电源直流电源和和电泳槽电泳槽两部分组成。两部分组成。一、直流电源一、直流电源 一般由交流电经过整流获得一般由交流电经过整流获得 恒压电源恒压电源 恒流电源恒流电源 恒功电源恒功电源9第9页，共32页，编辑于20

5、22年，星期一二、电泳槽二、电泳槽 盖盖 电极及电极室电极及电极室 支架支架10第10页，共32页，编辑于2022年，星期一常用的区带电泳常用的区带电泳n滤纸电泳滤纸电泳n醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳n琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳11第11页，共32页，编辑于2022年，星期一 影响电泳的因素影响电泳的因素1 1.电场强度电场强度2.2.缓冲液缓冲液npHpHn组成成分组成成分n离子强度离子强度12第12页，共32页，编辑于2022年，星期一3.3.支持物支持物n吸附作用吸附作用n电渗作用电渗作用4.4.虹吸作用虹吸作用5.5.样品样品13第13页，共

6、32页，编辑于2022年，星期一 不同的蛋白质具有不同的等电点，不同的蛋白质具有不同的等电点，利用具有线性利用具有线性pHpH梯度的电泳介质来分离梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质，这种电泳技术称等电点不同的蛋白质，这种电泳技术称为为等电聚焦电泳等电聚焦电泳。14第14页，共32页，编辑于2022年，星期一进行等电聚焦电泳的条件进行等电聚焦电泳的条件1.1.有一个在电泳条件下基本稳定的、有一个在电泳条件下基本稳定的、重复性良好的重复性良好的pHpH梯度。梯度。2.2.有一个抗对流的电泳材料。有一个抗对流的电泳材料。3.3.电泳后有适当的方法来鉴定电泳后有适当的方法来鉴定 分离的区带。分离的

7、区带。15第15页，共32页，编辑于2022年，星期一 双向电泳双向电泳是先把样品从一个方向进行是先把样品从一个方向进行电泳分离，接着再与其成电泳分离，接着再与其成9090方向进行第二方向进行第二次电泳分离。次电泳分离。第一次电泳以其电荷性质为基础；第二第一次电泳以其电荷性质为基础；第二次电泳则按分子量不同进行分离。次电泳则按分子量不同进行分离。16第16页，共32页，编辑于2022年，星期一 转移电泳转移电泳是将凝胶电泳的高分辩率是将凝胶电泳的高分辩率与放射标记或酶标记等免疫化学方法的与放射标记或酶标记等免疫化学方法的高灵敏度结合起来的电泳技术。高灵敏度结合起来的电泳技术。17第17页，共3

8、2页，编辑于2022年，星期一 1.1.用凝胶电泳分离蛋白质或核酸用凝胶电泳分离蛋白质或核酸 2.2.用电泳的方法将已分离的蛋白质或用电泳的方法将已分离的蛋白质或 核酸转移到硝酸纤维膜或重氮苄氨核酸转移到硝酸纤维膜或重氮苄氨 基甲基纸上。基甲基纸上。3.3.鉴定纸上的蛋白质或核酸鉴定纸上的蛋白质或核酸 其方法是：其方法是：18第18页，共32页，编辑于2022年，星期一 酶的活性酶的活性是指酶的催化能力的大小，是指酶的催化能力的大小，即酶促反应速度的快慢。在规定条件下，即酶促反应速度的快慢。在规定条件下，单位时间内底物减少的量或产物生成的单位时间内底物减少的量或产物生成的量来表示。量来表示。1

9、9第19页，共32页，编辑于2022年，星期一 酶活性的单位酶活性的单位是指在特定的条件下，是指在特定的条件下，使酶促反应达到某一速度所需要的酶量。使酶促反应达到某一速度所需要的酶量。20第20页，共32页，编辑于2022年，星期一1.1.惯用单位惯用单位 由方法的作者自己规定在某特定由方法的作者自己规定在某特定 条件下生成一定量的产物为一个单位。条件下生成一定量的产物为一个单位。2.2.国际单位（国际单位（IUIU）在规定的实验条件下，每分钟催在规定的实验条件下，每分钟催 化化1 1molmol底物发生反应的酶量。底物发生反应的酶量。3.Katal3.Katal 1 Katal 1 Kata

10、l是指在最适宜的条件下，是指在最适宜的条件下，每秒钟催化每秒钟催化1mol1mol底物发生反应的酶量。底物发生反应的酶量。21第21页，共32页，编辑于2022年，星期一 酶的比活性酶的比活性是指单位质量（是指单位质量（mgmg）的）的蛋白质所具有某种酶的活性。蛋白质所具有某种酶的活性。活性单位活性单位/mg/mg蛋白蛋白 比活性比活性是衡量酶纯度的一个指标。是衡量酶纯度的一个指标。22第22页，共32页，编辑于2022年，星期一酶活性测定的方法酶活性测定的方法：1.1.终点法终点法（又称二点法、固定时间法）（又称二点法、固定时间法）酶促反应一定时间后（从酶促反应一定时间后（从t t1 1到到

11、 t t2 2)终止酶促反应，然后测定产物生终止酶促反应，然后测定产物生 成的量或底物消耗的量。成的量或底物消耗的量。23第23页，共32页，编辑于2022年，星期一 优点优点 酶促反应已终止，比色计无需恒温酶促反应已终止，比色计无需恒温装置，不必考虑显色剂对酶的影响。装置，不必考虑显色剂对酶的影响。缺点缺点 无法了解酶作用这段时间里反应是否无法了解酶作用这段时间里反应是否外于零级反应期。外于零级反应期。24第24页，共32页，编辑于2022年，星期一 每隔一定时间（每隔一定时间（10106060秒）连续测定秒）连续测定酶促反应中某一产物或底物变化量称为连酶促反应中某一产物或底物变化量称为连续

12、监测法。续监测法。优点优点 省时、省试剂、省样品省时、省试剂、省样品 缺点缺点 反应速度易受温度、反应速度易受温度、pHpH、底物浓度、底物浓度等因素的影响。等因素的影响。2.2.连续监测法（又称速率法）连续监测法（又称速率法）25第25页，共32页，编辑于2022年，星期一（一）样品（一）样品 1.1.溶血溶血 2.2.抗凝剂抗凝剂 3.3.样品存放的时间样品存放的时间（二）测定条件（二）测定条件 1.1.温度温度 2.pH 2.pH 3.3.缓冲液的性质缓冲液的性质影响酶活性测定的因素影响酶活性测定的因素26第26页，共32页，编辑于2022年，星期一 名称名称 室温室温 4 -20 4

13、-20乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 7 7 30 7 7 30 天冬氨酸氨基转移酶天冬氨酸氨基转移酶 2 14 30 2 14 30丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 2 14 30 2 14 30肌酸激酶肌酸激酶 0.3 0.6 2 0.3 0.6 2碱性磷酸酶碱性磷酸酶 0.5 6 600 0.5 6 600淀粉酶淀粉酶 2 60 60 2 60 60几种酶的稳定性（天）几种酶的稳定性（天）27第27页，共32页，编辑于2022年，星期一1.1.提供一种活性稳定的酶标准品提供一种活性稳定的酶标准品2.2.由国家（或地区）推荐统一的测由国家（或地区）推荐统一的测 定方法定方法酶活性测定标准化的要求酶活

14、性测定标准化的要求28第28页，共32页，编辑于2022年，星期一 电泳法电泳法层析法层析法免疫化学法免疫化学法动力学法动力学法热失活法热失活法同工酶的分离及鉴定同工酶的分离及鉴定29第29页，共32页，编辑于2022年，星期一 酶学分析酶学分析是将酶作为试剂的一种分析是将酶作为试剂的一种分析技术，它包括：技术，它包括：1.1.借助酶来测定某化合物借助酶来测定某化合物 2.2.借助酶来测定另一种酶借助酶来测定另一种酶特点：特点：专一专一 高效高效 灵敏灵敏 温和温和30第30页，共32页，编辑于2022年，星期一 在许多酶促反应中，底物或产物的变在许多酶促反应中，底物或产物的变化量很难直接测定

15、，常需要在反应体系中化量很难直接测定，常需要在反应体系中加入一种或一种以上的酶作为试剂。使第加入一种或一种以上的酶作为试剂。使第一个酶促反应的产物转变为易于检测的第一个酶促反应的产物转变为易于检测的第二个酶或第三个酶的产物，通过这种偶联二个酶或第三个酶的产物，通过这种偶联反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待测酶的活性，这种作为试剂用的酶称为测酶的活性，这种作为试剂用的酶称为工工具酶具酶。A AB BC CP P31第31页，共32页，编辑于2022年，星期一 将水溶性的酶，通过物理或化学的将水溶性的酶，通过物理或化学的方法，使其吸附、包埋或其价结合在固方法，使其吸附、包埋或其价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保留催化相载体上，成为不溶于水但仍保留催化活性的酶的衍生物称为活性的酶的衍生物称为固相酶固相酶。优点：优点：可反复使用可反复使用 机械强度大机械强度大 稳定性好稳定性好 抗干扰性强抗干扰性强 32第32页，共32页，编辑于2022年，星期一