免疫组化原理和步骤(精).doc

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1、免疫组化原理和步骤(精)免疫组化原理及步骤 免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指 带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈 色反应，对相应抗原进行定性、定位、 定量测定的一项新技术。它把免疫反应 的特异性、组织化学的可见性巧妙地结 合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、 电子显微镜 的显像和放大作用，在细 胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 （如蛋 白质、多肽、酶、激素、病原体以及受 体等 .二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、 振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫 生纸、计时器和通风橱等。三、试剂配制1。 0。01 M PB

2、S(pH 7。34 ：9。0 g NaCl + 50 ml 0。2 M PB 加双蒸水至 1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7。4=5。93 g NaH 2 PO 4 2H 2 O+58。02 g Na 2 HPO 4 12H 2 O in 1000 ml 双蒸 水或=190 ml A + 810 ml B(A。 0。2 M NaH 2 PO 4 2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O； B. 0。2M Na 2 HPO 4 12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。2。 Citrate Buffered Saline(0

3、。01 M 柠檬酸缓冲液， PH6。0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 ：10。5 g 加双蒸水至 1000 ml ； B.Citrate sodium（柠檬酸钠：29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。3。 细胞通透液:由终浓度分别为 0。3双氧水和 0.3Triton X-100 混 合而成。 配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS， 再接着加 120 ul TritonX100,并加热一儿,冷却至临用前加 0。4 ml30H 2 O 2 。4。 5%羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释.5。 含 0。0

4、3H 2 O 2 的 0。05DAB (避光 :用 20DAB （1， 10 mg/ml 5 ul+0。1 ul 30 H 2 O 2 +95 ul PBS .6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。7。 Xylene 、 梯度 Ethanol （1002、 95、 80%、 70、 50、双蒸水、 中性树胶（封裱剂。8. 苏木精染液:四、操作步骤1 、脱蜡、水化 1 60 20 minXylene 2 10 minutes ;2 100 absolute ethanol：2 5 minutes ；3 95 ethanol 2 minutes；4 80% ethanol 2 minutes;5 7

5、0 ethanol 2 minutes;6 distilled water:5 min;7 PBS 洗 3 次 3 min。2、细胞通透、封闭内 源性过氧化物酶8 用封闭通透液浸润切片 30 min （RT 避光 。 配法是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加热几分钟后, 临用前加 400 ul 30%H 2 O 2 。9 PBS 溶液洗 3 次 3 min。3、抗原修复暴露抗原 决定族10 切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲 溶液（pH6。0后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾后， 再加热约 6 min4 次, 每次间隔补足液体,防止干片。4、封闭非特异

6、性蛋白11 PBS 溶液洗 3 次 3 min; 12 将切片取出 ， 周围水分用滤纸吸干 , 用组化笔在组织周围画上圈 ， 在圆圈内 组织滴入 5羊血清 (与二抗来源一致 后放入湿盒中 ， 室温 30(1030 min ;5、一抗孵育13 甩去切片上的羊血清 , 用滤纸擦干 组织周围残留血清,直接加入已稀释的 一抗(1:250、 500、 1000后，放入 湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜, 从冰箱中取出需 37 复温 45 min。 6、二抗孵育14 将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min5 次;15 用滤纸将圆圈周围的水吸去, 加入 已稀释的二抗后放入 37 恒温烤箱 中 30 m

7、in (回收。16 用 PBS 洗 5 次 5 min;7、 SP 反应17 加入 SP 后放入 37 度烤箱中 30 min。18 用 PBS 洗 5 次 5 min；8、显色19 加入 DAB （快速滴入，观察染色 情况, 倒掉染液 , 显色时间控制在约 5 min （310 min，由镜下观察颜色控 制时间。 0.05%DAB （避光 (1:20 储 备液：5 ul 20DAB +0。1 ul 30 H 2 O 2 +95 ul PBS。 1DAB 储备液的 制 ：50mgDAB+5ml 0。05 mol/L PBS 充分溶解, 20 保存.9、复染、脱水、透明、 封片20 用 PBS

8、3 次 3min 后， 用双蒸水 洗 5 min;21 加一大滴苏木素染液， 胞核蛋白染 几秒，胞浆或胞膜蛋白染 20 s 后自来 水冲洗，双蒸水洗 5 min,再用 PBS 返蓝 5 min 。22 脱水：50 ethanol 1-2 min，70 ethanol 12 min95% ethanol 12 min；95 ethanol 12 min;100 absolute ethanol: (12 min; 100% absolute ethanol: （1-2 min. 23 透明:Xylene 1（1-2min Xylene 2(12 min24 封片:中性树胶。五、注意事项1. 苏木

9、素复染时间需要摸索，尤其 阳性染色也在细胞核上。2. DAB 显色时间需要达到最优化， 镜下观察达到阳性染色明显但背景不太 深。3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸 索.尤其一抗孵育最好在 4 度过夜。4。 切片脱蜡和水化要充分;加反应 液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干 洗涤液，但又防止干片;用组化笔画圈 时尽量画大一点,否则墨水排斥液体, 引起片周边干片。5。 片子着色不均匀的原因如下: 脱蜡不充分。可以 60 烤 20 min ,立即放入新鲜的 xylene1； 水化不全.应经常配制新鲜的梯度 乙醇； 抗体没混匀.用移液器充分混匀一 抗 /二抗等试剂; 抗体孵育时，切片放倾斜; 抗体孵育后

10、 PBS 冲洗不充分。 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不 平,切片倾斜.6。 一抗从 4 拿出后,为什么有人说 要 37 度复温,目的是什么？ 一方面， 防止切片从 4 直接放入 PBS 易脱片; 另一方面，使抗原 抗体结合更稳定.一般不需要 , 但对表达 较弱的抗原可能有用 ,4 和 37 度时分子运动方式不同 , 前者分子碰撞机 率和运动速度小于后者 , 后者结合更快 , 但敏感性也提高了并易造成非特异染 色。7。 切片染色后背景太深，不易区分特异 性与非特异性着色？ 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易 增加背景着色。这可通过缩短一抗 /二抗 孵育时间、稀释抗体来控制; 一抗用多克隆抗体易出现非特异性 着色，建议试用单克隆抗体看看； 内源性过氧化物酶和生物素在肝 脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延 长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背 景染色; 非特异性组分与抗体结合,这需要 通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭 时间和适当增加浓度来加强封闭效果; DAB 显色时间过长或浓度过高； PBS 冲洗不充分, 残留抗体结果增 强着色； 标本染色过程中出现干片，易增强 非特异性着色.建议您到杭州百替生物的主页上来看 看,有详细的步骤，我们也可以专业代 做免疫组化实验哦!