《毛细管电泳法》PPT课件.ppt

《《毛细管电泳法》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《毛细管电泳法》PPT课件.ppt（29页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、目录目录毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型毛细管电泳法仪器构造毛细管电泳法仪器构造毛细管电泳法特点毛细管电泳法特点CE-MS构造构造毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理CE统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。分离的一类液相分离技术。通常采用通常采用2574m内径、长内径、长3880cm的弹性石英毛细的弹性石英毛细管，使用管，使用1030kV直流电压，形成高强度电场。由于细直流电压，形

2、成高强度电场。由于细管径的毛细管电阻率大、电流小，有效地抑制了焦耳热管径的毛细管电阻率大、电流小，有效地抑制了焦耳热效应，而且具有较大的散热比表面积，也限制了电泳过效应，而且具有较大的散热比表面积，也限制了电泳过程中溶液温度升高，使得分离柱效高，分离速度快。程中溶液温度升高，使得分离柱效高，分离速度快。毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理电泳：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，电泳：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度以不同的速度 向其所带电荷相反方向迁移的现象。向其所带电荷相反方向迁移的现象。q6rr EVep=ep E=Vep为离子电泳迁移速度为离子电泳迁移速度ep为

3、电泳淌度为电泳淌度E为电场强度为电场强度 q为离子电荷量为离子电荷量为介质粘度为介质粘度r为离子半径。为离子半径。半径小、电荷高的组分半径小、电荷高的组分具有大的迁移率，而半具有大的迁移率，而半径大、电荷低的组分具径大、电荷低的组分具有小的迁移率。有小的迁移率。毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理CE所用的石英毛细管柱，在所用的石英毛细管柱，在pH 3情况下，其内情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。电渗：在高电压作用下，双电层中的水合阳离子电渗：在高电压作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象。引起流体整体地朝负

4、极方向移动的现象。毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理影响因素：影响因素：pH值（值（pH越高，电渗流越大）越高，电渗流越大）离子强度（离子强度越高，电渗流越小）离子强度（离子强度越高，电渗流越小）缓冲溶液添加剂（离子型表面活性剂、有机溶剂）缓冲溶液添加剂（离子型表面活性剂、有机溶剂）方法结果说明电场强度正比于电渗.电场强度降低分离效率和分辨率的降低.电场强度增加，焦耳热增加缓冲溶液pH值pH降低，电渗降低pH降低，电渗增加.改变电渗最方便有用的方法.可能会引起溶质组分电荷和结构的改变离子强度或缓冲溶液浓度离子强度增加，Zeta电位降低，电渗降低.离子强度增加，电流和焦耳热增加.低离子强度

5、可能存在样品的吸附问题.导电性与样品不同可能引起峰形畸变.离子强度低，样品装载量小温度温度改变1，黏度变化约2%-3%.温度由仪器自动控制，常用方法有机改性剂改变Zeta电位和黏度（降低电渗）.变化复杂，其影响宜通过实验测定.可能改变选择性毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（EOF）两种速度的矢量和。两种速度的矢量和。正离子正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流的运动方向和电渗流一致，故最先流出；出；中性粒子中性粒子的电泳流速度为的电泳流速度为“零零”，故其迁移速度相当于电渗，故其迁移速度相

6、当于电渗流速度；流速度；负离子负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。种粒子迁移速度不同而实现分离。毛细管电泳法基本原理毛细管电泳法基本原理V=Vep+Veo=(ep+eo)E毛细管电泳法仪器构造毛细管电泳法仪器构造毛细管电泳法仪器构造毛细管电泳法仪器构造v毛细管柱是毛细管柱是CE的核心部件，目前多为的核心部件，目前多为2575m之间，之间，材料为聚四氟乙烯、玻璃和弹性石英，以石英居多。材料为聚四氟乙烯、

7、玻璃和弹性石英，以石英居多。v选择细内径毛细管柱有利于最大散热，但选择细内径毛细管柱有利于最大散热，但比表面积大，比表面积大，会增加溶质的吸附作用。会增加溶质的吸附作用。高压电源：包括电源、电极和电极槽高压电源：包括电源、电极和电极槽进样系统：电动进样、压力进样进样系统：电动进样、压力进样毛细管电泳法仪器构造毛细管电泳法仪器构造检测方式检测方式质量检测限质量检测限(mol)浓度检测限浓度检测限(M)*优缺点优缺点紫外紫外-可可见光吸收见光吸收10-1310-1610-510-8接近通用型接近通用型DAD可给出光谱信息可给出光谱信息荧光荧光10-1510-1710-710-9灵敏度高灵敏度高样品

8、常需衍生化样品常需衍生化激光诱导激光诱导荧光荧光10-1810-2010-1410-16极端灵敏极端灵敏样品常需衍生化样品常需衍生化安培安培10-1810-1910-1010-11选择性好选择性好用专门装置测电活性组分用专门装置测电活性组分电导电导10-1510-1610-710-8通用型通用型用专门装置和毛细管处理用专门装置和毛细管处理质谱质谱10-1610-1710-810-9灵敏，可给出结构信息灵敏，可给出结构信息接口复杂接口复杂检检测测系系统统毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE)毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（

9、CIEF）毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（CITP）毛细管胶束电动色谱毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC）微乳液毛细管电动色谱（微乳液毛细管电动色谱（MEEKC）毛细管电色谱（毛细管电色谱（CEC）亲和毛细管电泳（亲和毛细管电泳（ACE）非胶毛细管电泳（非胶毛细管电泳（NGCE）毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管区带电泳定义：溶质在毛细管内的背景电解质溶液中以不同定义：溶质在毛细管内的背景电解质溶液中以不同 速度迁移而形成一个个独立的溶质带的电泳速度迁移而形成一个个独立的溶质带的电泳 模式模式特点：简单，是特点：简单，是CE中应用最广泛的一种操作模式。中应用最广泛的一种操作模式。缺点

10、：不能分离中性物质，因中性物质的淌度差为零。缺点：不能分离中性物质，因中性物质的淌度差为零。性质：基于样品中各个组分间性质：基于样品中各个组分间质荷比的差异质荷比的差异定性依据：不同组分的迁移时间不同定性依据：不同组分的迁移时间不同定量依据：电泳峰的峰面积或峰高定量依据：电泳峰的峰面积或峰高荷荷/质比越大质比越大跑得越快！跑得越快！毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管凝胶电泳毛细管中装入凝胶作支持物进行的电泳。因凝胶具毛细管中装入凝胶作支持物进行的电泳。因凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，使溶质按有多孔性，起类似分子筛的作用，使溶质按分子量分子量大小大小逐一分离。且凝胶黏度大，可减少溶质

11、的扩散，逐一分离。且凝胶黏度大，可减少溶质的扩散，使被分离组分峰形尖锐，以达到最高柱效。使被分离组分峰形尖锐，以达到最高柱效。关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺。关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺。主要用于核酸片断及蛋白分子量分析主要用于核酸片断及蛋白分子量分析缺点：制作麻烦，寿命短缺点：制作麻烦，寿命短毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管等电聚焦基本原理：基于两性电介基本原理：基于两性电介质在分离介质中的迁移造质在分离介质中的迁移造成的成的pH梯度，使物质根据梯度，使物质根据它们它们不同的等电点不同的等电点达到分达到分离的目的。具有一定等电离的目的。具有一定等电点的物质顺着这

12、一梯度迁点的物质顺着这一梯度迁移到相当于其等电点的那移到相当于其等电点的那个位置，并在此停下，产个位置，并在此停下，产生非常窄的聚焦带，并使生非常窄的聚焦带，并使不同等电点的蛋白聚焦在不同等电点的蛋白聚焦在不同位置上。不同位置上。优点：极高的分辨率，可以分离等电点差异优点：极高的分辨率，可以分离等电点差异0.01pH单位的两种蛋白质。单位的两种蛋白质。毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管等速电泳较早采用的模式，目前应用不多。较早采用的模式，目前应用不多。选用淌度比样品中任何待测组分的淌度都高的电解选用淌度比样品中任何待测组分的淌度都高的电解质作为先导电解质，用淌度比样品中任何待测组分的质作

13、为先导电解质，用淌度比样品中任何待测组分的淌度都低的电解质作为尾随电解质，夹在先导电角质淌度都低的电解质作为尾随电解质，夹在先导电角质和尾随电解质之间的样品组分根据各自的和尾随电解质之间的样品组分根据各自的有效淌度不有效淌度不同同而分离，达到平衡时，各组分区带上电场强度的自而分离，达到平衡时，各组分区带上电场强度的自调节作用使各组分区带具有相同的迁移速率。调节作用使各组分区带具有相同的迁移速率。常用于分离离子型物质。常用于分离离子型物质。毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管胶束电动色谱电解质中加入表面活性剂，使之形成胶束，样品根据电解质中加入表面活性剂，使之形成胶束，样品根据其其疏水性强弱

14、疏水性强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离，样品疏水性愈強，则进入胶束的所不同來进行分离，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管胶束电动色谱优点：优点：增加对弱极性物质分离的分离度增加对弱极性物质分离的分离度 在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用 毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物毛细管电泳中唯

15、一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。质的分离模式。缺点：缺点：稳定性不佳，达到好的重复性比较困难稳定性不佳，达到好的重复性比较困难毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 微乳液毛细管电动色谱实质：在毛细管区带电泳缓冲液加入水包油乳液高分实质：在毛细管区带电泳缓冲液加入水包油乳液高分 子离子。子离子。微乳液是由正构烷烃、表面活性剂、辅助表面活性剂、微乳液是由正构烷烃、表面活性剂、辅助表面活性剂、缓冲液通过超声处理而组成的稳定透明液体，纳米级，缓冲液通过超声处理而组成的稳定透明液体，纳米级，分散在缓冲液中作为假固定相。分散在缓冲液中作为假固定相。在在MEEKC分离过程中，被分析物的分离过程中，被

16、分析物的疏水性疏水性不同，同微不同，同微 乳液滴的亲和作用也不同。其乳液滴的亲和作用也不同。其脂溶性脂溶性越强，和微乳液滴越强，和微乳液滴 的亲和作用就越强，迁移时间也越长。的亲和作用就越强，迁移时间也越长。可用于分离多环芳烃、固醇类化合物、脂溶性维生素、可用于分离多环芳烃、固醇类化合物、脂溶性维生素、糖类，蛋白类以及药物、手性分离和中性化合物糖类，蛋白类以及药物、手性分离和中性化合物毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 微乳液毛细管电动色谱十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（EWE）是）是MEEKC中最常用的阴离子表面活性中最常用的阴离子表面活性剂，它分布于微乳液滴表面使其带负电荷，在电场力作用下，

17、微剂，它分布于微乳液滴表面使其带负电荷，在电场力作用下，微乳液滴被阳极吸引，与电渗流的方向刚好相反，但是电渗流的速乳液滴被阳极吸引，与电渗流的方向刚好相反，但是电渗流的速度要大于液滴的速度，所以带负电荷的微乳液滴向阴极移动。由度要大于液滴的速度，所以带负电荷的微乳液滴向阴极移动。由于中性物质和微乳液滴表面的活性剂没有电荷相互作用，其色谱于中性物质和微乳液滴表面的活性剂没有电荷相互作用，其色谱过程的分离机制就是电渗流驱动；带正电的物质和微乳表面的负过程的分离机制就是电渗流驱动；带正电的物质和微乳表面的负电荷有离子对的相互作用，带负电的物质和微乳液表面的负电荷电荷有离子对的相互作用，带负电的物质和

18、微乳液表面的负电荷有互斥作用，因此它们的分离过程是电泳和色谱综合作用的结果。有互斥作用，因此它们的分离过程是电泳和色谱综合作用的结果。毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 毛细管电色谱是将是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，但增为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，但增加了选择性。加了选择性。有发展前景的方法。有发展前景的方法。毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 亲和毛细管电泳亲和毛细管电泳是指亲和毛细管电泳是指在电

19、泳过程中具有生在电泳过程中具有生物专一性亲和力的两物专一性亲和力的两种分子（受体和其配种分子（受体和其配体）间，发生了特异体）间，发生了特异性相互作用，形成了性相互作用，形成了受体受体配体复合物，配体复合物，从而与其它物质分离，从而与其它物质分离，该方法特别适用于生该方法特别适用于生物活性分子如蛋白质、物活性分子如蛋白质、抗生素、核酸等的分抗生素、核酸等的分析以及药物中的手性析以及药物中的手性选择。选择。毛细管电泳法类型毛细管电泳法类型 非胶毛细管电泳指介质中以有机溶剂占主要部分，即表现为非水体指介质中以有机溶剂占主要部分，即表现为非水体系的性质。能承受更高的操作电压产生的高电场，系的性质。能

20、承受更高的操作电压产生的高电场，有更高的分享效率，也可在不增大焦耳热的条件下有更高的分享效率，也可在不增大焦耳热的条件下提高溶液中的离子浓度或增大毛细管的内径，从而提高溶液中的离子浓度或增大毛细管的内径，从而增大进样量。增大进样量。优点：使用超大内径毛细管柱、快速分析、降低吸优点：使用超大内径毛细管柱、快速分析、降低吸附、提高分离选择性、有利于难溶于水及在水中不附、提高分离选择性、有利于难溶于水及在水中不稳定的化合物的分离、对中性物质的分离、对手性稳定的化合物的分离、对中性物质的分离、对手性物质的分离物质的分离毛细管电泳法特点毛细管电泳法特点与传统电泳技术相比：与传统电泳技术相比：分离效率高：

21、解决了因提高电压带来的焦耳热问题分离效率高：解决了因提高电压带来的焦耳热问题 分离模式多：由电渗流和电泳流共同作用结果，故有多种分类分离模式多：由电渗流和电泳流共同作用结果，故有多种分类 应用范围广：有机、无机小分子，多肽、蛋白质大分子应用范围广：有机、无机小分子，多肽、蛋白质大分子 带电离子，中性分子带电离子，中性分子 最小检出限低最小检出限低 分析成本低：毛细管本身成本低，溶剂和试剂消耗量少分析成本低：毛细管本身成本低，溶剂和试剂消耗量少 样品用量少：仅为纳升级（样品用量少：仅为纳升级（10-9L）仪器简单：只需一个高压电源、一个检测器、一截毛细管仪器简单：只需一个高压电源、一个检测器、一

22、截毛细管 环境友好：分离介质多为水相，且产生废液量少，环境影响小。环境友好：分离介质多为水相，且产生废液量少，环境影响小。毛细管电泳法特点毛细管电泳法特点与高效液相色谱相比的特点：与高效液相色谱相比的特点：对比点对比点毛细管电泳法毛细管电泳法高效液相色谱高效液相色谱流体流动形流体流动形式式平流，峰展宽小平流，峰展宽小层流，峰尾宽大层流，峰尾宽大作用力作用力电渗流和电泳流电渗流和电泳流压力流压力流柱效柱效高，不存在传质阻力，高，不存在传质阻力，分子扩散很小分子扩散很小低，存在涡流扩散、低，存在涡流扩散、传质阻力、分子扩散传质阻力、分子扩散组分分离原组分分离原理理迁移速率不同迁移速率不同分配系数不

23、同分配系数不同适用范围适用范围生物大分子生物大分子相反相反CE的优点可概括为的优点可概括为三高二少三高二少：高灵敏度高灵敏度，常用紫外检测，常用紫外检测器的检测限可达器的检测限可达10-110-15mol，激光诱导荧光检测器则，激光诱导荧光检测器则达达10-1910-21mol；高分辨率高分辨率，其每米理论塔板数为几，其每米理论塔板数为几十万，高者可达几百万乃至千万，而十万，高者可达几百万乃至千万，而HPLC一般为几千一般为几千到几万；到几万；高速度高速度，最快可在，最快可在60s内完成，有内完成，有250s内分离内分离10种蛋白质、种蛋白质、1.7min分离分离19种阳离子及种阳离子及3mi

24、n内分离内分离30种阴离子的报道；种阴离子的报道；样品少样品少，只需，只需nL10-9L）级的进样量；）级的进样量；成本低成本低，只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的毛细，只需少量（几毫升）流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力，使管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力，使CE成成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。毛细管电泳法特点毛细管电泳法特点CE-MS构造构造实现实现CE-MS联用面临的主要问题是联用面临的主要问题是CE背景缓冲液中的背景缓冲液中的盐、毛细管壁涂层材料或者盐、毛细管壁涂层材料或者MEKC中的表面活性剂等中的

25、表面活性剂等会降低被分析物的离子化效率甚至严重污染会降低被分析物的离子化效率甚至严重污染MS离子源。离子源。CE-MS在线联用的离子源包括快原子轰击在线联用的离子源包括快原子轰击(FAB)、电喷雾电离电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离、大气压化学电离(APCI)、电感、电感耦合等离子体耦合等离子体(ICP)、大气压光电离、大气压光电离(APPI)等等在在MS方面方面,几乎各种不同类型质量分析器的质谱仪都可与几乎各种不同类型质量分析器的质谱仪都可与CE联联用用,其中三重四极杆质谱其中三重四极杆质谱(TQ-MS)和离子阱质谱和离子阱质谱(IT-MS)以其仪以其仪器简单、分析速度快的特点应用最为广

26、泛器简单、分析速度快的特点应用最为广泛;与之相比与之相比,飞行时间飞行时间质谱质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱FT-ICR-MS)适用适用于分析更大的分子于分析更大的分子,并且具有更高的质量分辨率和准确度并且具有更高的质量分辨率和准确度,进一进一步提高了步提高了CE-MS的分析能力。的分析能力。CE-MS构造构造电喷雾电离（电喷雾电离（ESI）接口技术于）接口技术于1984年在年在MS中提出，溶液在高场中提出，溶液在高场中毛细管端以中毛细管端以1-10ul/min的流速喷射进入的流速喷射进入MS检测器。接着，检测器。接着，whitehouse等人等人

27、8的的LC-ESI-MS接口问世。但是，对于接口问世。但是，对于LC-MS的接口都不能直接由的接口都不能直接由CE-MS加以利用，主要原因有两个：一是加以利用，主要原因有两个：一是CE流量小、流速慢（大多为流量小、流速慢（大多为10100nl/min）,不能满足各种接口不能满足各种接口对流速的要求（对流速的要求（210ul/min）；二是由于毛细管端不存在缓冲液）；二是由于毛细管端不存在缓冲液中，所以必须解决中，所以必须解决CE操作中的电接触问题，保证提供分离电流操作中的电接触问题，保证提供分离电流回路。不过基于回路。不过基于whitehouse等人的等人的LC-MS接口理论，接口理论，smi

28、th等等9将将CE分离毛细管的出口端作喷射源，首先实现了分离毛细管的出口端作喷射源，首先实现了CE-ESI-MS的在线偶合。电喷雾（的在线偶合。电喷雾（ESI）接口作为最早出现的在线联用接口）接口作为最早出现的在线联用接口技术，使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子技术，使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子质量达几万甚至十几万的生物大分子。由于质量达几万甚至十几万的生物大分子。由于ESI自身的优势以及自身的优势以及CE-ESI-MS接口技术的日益趋于成熟接口技术的日益趋于成熟,使使CE-ESI-MS已成为已成为CE-MS联用技术中占主导地位的方法。联用技术中占主导地位的方法。CE-ESI-MS接口主要分为鞘接口主要分为鞘液接口和无鞘液接口两种。液接口和无鞘液接口两种。谢 谢！请批评指正