《犬小孢子菌》PPT课件.ppt

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1、犬小孢子菌犬小孢子菌SSH文库文库中差异基因的研究中差异基因的研究硕士研究生：张渊硕士研究生：张渊指指 导导 教教 师：杨国玲师：杨国玲 教授教授专专 业业 名名 称：皮肤病与性病称：皮肤病与性病前 言|犬小孢子菌主要侵犯儿童|引起白癣、脓癣和体癣|儿童头癣48%儿童体癣36%成人头体癣16%研究背景1.儿童皮脂腺发育不完全儿童皮脂腺发育不完全 2.犬小孢子菌蛋白酶的作用犬小孢子菌蛋白酶的作用犬小孢子犬小孢子菌儿童头癣菌儿童头癣发病机制发病机制推测儿童头皮是否诱导推测儿童头皮是否诱导犬小孢子菌毒力因子犬小孢子菌毒力因子？材 料|前期试验克隆：前期试验克隆：菌液PCR，菌液克隆|主要试剂：主要试

2、剂：1.DIG High Prime Labeling&Detection Starter Kit I 2.杂交膜 3.Real time PCR Kit|主要仪器：主要仪器：1.CL1000紫外交联仪（UVP）2.Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System儿童头皮培养菌株(tester)儿童光滑皮肤培养菌株(driver1)成人头皮组织培养菌株(driver2)斑点杂交斑点杂交实时实时PCR技术路线获得差获得差异基因异基因前期完成试验消减文库SSH方法-斑点杂交正反向消减文库PCR扩增制备探针制备探针酶切回收杂交膜杂交膜DIG-High Prim

3、er 探针菌液菌液PCRPCR产物产物阳性克隆测序n阳性克隆菌液送大连宝生物测序：菌种为DH10B，载体为PMD-T18 n测序使用引物为：F Primer（M13-47）；R Primer（RV-M）测序分析实时PCR TestermRNADriver1mRNADriver2mRNA2个基因 2个基因 18S rRNA 3个RNA池均为构建消减文库时保存的总RNA 探针引物序列结 果消减文库酶切前后结果结 果-斑点杂交消减文库消减文库1 1斑点杂交部分结果斑点杂交部分结果正向 反向正向反向消减文库消减文库2 2斑点杂交部分结果斑点杂交部分结果 结 果-斑点杂交阳性克隆测序及分析 共得到共得到

4、106个有效序列个有效序列共得到共得到13个个ESTs8个个ESTs找到了同源基因找到了同源基因6个同源基因具有功能分类个同源基因具有功能分类消减文库1差异基因比对结果消减文库2差异基因比对结果蛋白功能分类实时PCR-18s rRNA18s rRNA基因在3个RNA池中的实时PCR表达情况 FSH1基因在tester RNA池和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR-FSH1PQ-LRP基因在tester RNA和driver 1 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR-PQ-LRP P-GAL4基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表

5、达情况 实时PCR-P-GAL4NADH1基因在tester RNA池和driver 2 RNA池中的实时PCR表达情况 实时PCR-NADH14个ESTs表达的相对表达倍数关系 讨 论犬小孢子菌犬小孢子菌致病因子表达致病因子表达犬小孢子菌犬小孢子菌主要致儿童头癣主要致儿童头癣儿童头皮组织儿童头皮组织结构蛋白差异结构蛋白差异利用利用SSH可能影响可能影响讨 论Tester和driver作为探针低丰度基因的丢失正反向消减DNA作为探针避免低丰度基因的丢失高背景，阳性率降低去掉接头降低背景，筛选差异基因实时PCR实时监测 高特异性高灵敏性 讨 论儿童头皮培养菌株儿童光滑皮肤培养菌株构建文库富集差异

6、基因成人头皮培养菌株讨 论讨 论-FSH1n目前对FSH1的研究主要是对其结构的分析nFSH1是酯酶，水解疏水磷酸酯、油酯化合物 nFSH家族功能较多：蛋白酶作用、调控因子作用等nFSH1在此发挥蛋白酶作用还是调控因子作用还不清楚Sophie Quevillpn-cheruel 讨 论-PQ-LRPnPQ-LRP蛋白是膜绑定蛋白，拥有一对重复的环结构（环1和环2）n环2对半胱氨酸载体定位于溶酶体至关重要 n半胱氨酸载体调控半胱氨酸代谢nPQ-LRP基因的上调表达，可能与半胱氨酸的代谢增强有关 nPQ-LRP基因可能是犬小孢子菌的重要致病因子 讨 论-NADH1nNADH1是呼吸链的组成部分，参

7、与ATP的生成n犬小孢子菌ATP利用率的增加，可能与其在儿童头皮组织中生长更活跃有关 讨 论-P-GAL4nP-GAL4基因属于GAL4家族，含有一个真菌中独有的GAL4域 nGAL4家族普遍的功能是转录调节，主要调控氮源代谢、生殖繁殖等n在本研究中，P-GAL4基因在此可能是调控真菌的生殖，导致犬小孢子菌在儿童的头皮组织中大量繁殖，导致头癣的发生 结 论nSSH1文库得到5个差异基因：1.FSH1 2.PQ-LRP 3.multidrug resistance protein MDR 4.RING zinc finger protein 5.RING zinc finger protein,putative 结 论nSSH2文库3个差异基因：1.P-GAL4 2.NADH1 3.DNA-directed RNA polymerase I subunit结 论nFSH1和PQ-LRP基因可能在犬小孢子菌致头癣的发病机制中起重要作用nP-GAL4和NADH1基因可以作为研究犬小孢子菌致头癣的候选基因 导师杨国玲教授张振颖老师大连理工大学金礼吉教授师姐张芙蓉全体皮肤科老师致 谢