《疫印迹技术》PPT课件.ppt

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1、蛋白样本制备与免疫印迹蛋白样本制备与免疫印迹（Immunoblottingtechnique）南京中医药大学生物化学与分子生物学系郭郭军军教授教授基本概念基本概念l印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。l19751975年，年，SouthernSouthern建立了将建立了将DNADNA转移到硝酸纤维素膜转移到硝酸纤维素膜（NCNC膜）上，并利用膜）上，并利用DNADNARNARNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNADNA片片段的方法，称为段的方法，称为South

2、ern印迹法。l而后人们用类似的方法，对而后人们用类似的方法，对RNARNA和蛋白质进行印迹分析，和蛋白质进行印迹分析，对对RNARNA的印迹分析称为的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法Western Blot基本原理一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。其基本过程主要有三个工序：1、将蛋白质经凝胶电

3、泳按分子量大小不同依次分离；2、将分离的组分转印到印迹膜上；3、对转印到印迹膜上的蛋白成分进行免疫学检测。123Western Blot一般流程一般流程l蛋白样品的制备蛋白样品的制备l蛋白含量测定蛋白含量测定l蛋白质变性蛋白质变性lSDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 凝胶电泳凝胶电泳l转膜转膜l免疫学检测免疫学检测l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色l曝光、显影、定影一一 蛋白样本制备蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础1、制备蛋白、制备蛋白样本样本的目的的目的 体外活性测定（活性测定（in vitro assay）免疫印迹杂交免疫印迹杂交(Immunoblot)免疫沉淀或共沉淀免

4、疫沉淀或共沉淀(Immunoprecipitation)双向电泳（双向电泳（two-dimensional electrophoresis）电泳迁移率变动分析电泳迁移率变动分析（EMSA）染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)3、方法的选择、方法的选择2、蛋白质的性质、分类与分布、蛋白质的性质、分类与分布种类：细胞、组织、微生物、酵母种类：细胞、组织、微生物、酵母亚细胞定位：亚细胞定位：胞浆、胞膜、胞核、细胞器胞浆、胞膜、胞核、细胞器性质：水溶、脂溶性质：水溶、脂溶其他：含量多少、分子量大小、磷酸化等其他：含量多少、分子

5、量大小、磷酸化等自行配制抽提试剂自行配制抽提试剂,根据文献根据文献方方法或法或经验提取经验提取购买购买商品化试剂盒商品化试剂盒,按其说明书按其说明书的方法提取的方法提取二二细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备高速离心收集高速离心收集高速离心收集高速离心收集上清即得全蛋上清即得全蛋上清即得全蛋上清即得全蛋白样本白样本白样本白样本细胞加入裂解细胞加入裂解液冰上放置液冰上放置10-1510-15分钟分钟蛋白定量和蛋白定量和蛋白定量和蛋白定量和SDS-PAGESDS-PAGE检测检测检测检测裂解样品裂解样品离心收集离心收集定量检测定量检测1 1、组织或细胞破碎、组织或细胞破碎u机械匀浆机械匀浆 组织分

6、散机、玻璃组织分散机、玻璃u超声破碎超声破碎u反复冻融反复冻融 干冰反复于零下1520使之冻固，然后缓慢地融解，反复操作u低渗溶液低渗溶液 u去污裂解液去污裂解液 表面活性剂有阴离子型（如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等），阳离子型（如氧化苄烷基二甲基铵等）及非离子型（TritonX-100、TirtonX-114、吐温60及吐温80）等。2、细胞裂解液、细胞裂解液表面活性剂表面活性剂缓冲液缓冲液蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：其它：H2O、NaCl、等、等还原剂还原剂RIPABufferCompany Logo2.1 缓冲液缓冲液稳定稳定pH环境，使蛋白保持自然构象，增

7、加溶解性。环境，使蛋白保持自然构象，增加溶解性。有有Tris-HCl，HEPES(H+)，MOPS等体系（等体系（pH7.5)2.2 表面活性剂表面活性剂 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为分为1阴离子型阴离子型:SDS，脱氧胆酸盐脱氧胆酸盐2阳离子型阳离子型:CPB和CTAB3双性离子型双性离子型:CHAPS和Zwittergent系列4非离子型非离子型:Brij系列、Triton-100、NonidetP40、Tween系列等2.3蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入抑制蛋

8、白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入2.4磷酸酶抑制剂选择磷酸酶抑制剂选择抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入使用前临时加入磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。）。常规的抑制剂主要包括：常规的抑制剂主要包括：试剂名称试剂名称抑制作用抑制作用氟化钠氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸酸性磷酸酶，丝

9、氨酸/苏氨酸磷酸酶苏氨酸磷酸酶正钒酸钠正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠焦磷酸钠丝氨酸丝氨酸-苏氨酸磷酸苏氨酸磷酸.2.5 2.5 还原剂还原剂还原剂还原剂 防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、巯基巯基乙醇等。乙醇等。2.6 2.6 其它其它其它其它 水；溶剂水；溶剂;NaCl。超纯水的电阻率就是单位厘米内的水的电阻值。即18.25M*CM.2.7全蛋白抽提时注意事项全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘可以适量加入甘油油,稳定蛋白稳定蛋白注意事项注意事项可以适量加入可以适量加入Benzonase/DNaseI等核酸等核酸酶

10、酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Detergent的种的种类类纯度纯度浓度浓度干干扰扰去除等因素去除等因素Temperature试剂和器皿冰上试剂和器皿冰上预冷预冷,低温低温4操操作作细胞或组织的样细胞或组织的样本量本量裂解液的用量裂解液的用量2.8细胞裂解液细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点三三蛋白样本制备产品选择蛋白样本制备产品选择1、核蛋白样本制备、核蛋白样本制备抽提原理抽提原理低渗裂解细胞膜低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与释放出胞浆蛋白与胞核胞核;离心分离出

11、胞核离心分离出胞核;高渗破裂胞核高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解加核酸酶降解DNA,释放出释放出DNA结结合蛋白合蛋白(组蛋白和转录因子组蛋白和转录因子)实验注意事项实验注意事项试剂和器皿冰上预冷试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量裂解液的用量细胞总量细胞总量抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶：蛋白酶抑制剂2、膜蛋白样本制备、膜蛋白样本制备3、亚细胞分级抽提、亚细胞分级抽提v用用超离心技术超离心技术分离出分离出细胞细胞器、质膜和细胞核器、质膜和细胞核等成分，等成分，再用适当的蛋白质溶解液再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅进行溶解。其优点是不仅大大大大减少样品

12、的复杂性减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进而且可对分离的蛋白质进行行亚细胞定位亚细胞定位。但该法需。但该法需要专业仪器，有时会出现要专业仪器，有时会出现假阳性。假阳性。v根椐根椐胞浆胞浆/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白蛋白的亚细胞策略用不同的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解提取液逐级溶解四种亚细胞组分分离提取的结果四种亚细胞组分分离提取的结果5、其它蛋白抽提产品、其它蛋白抽提产品l高丰度蛋白去除试剂盒高丰度蛋白去除试剂盒l信号蛋白提取试剂盒信号蛋白提取试剂盒l糖蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒l细菌蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒l酵母蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒l植物蛋白提取试剂盒植

13、物蛋白提取试剂盒四四蛋白定量产品选择指南蛋白定量产品选择指南1、BCA法蛋白定量法蛋白定量 BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（螯合剂（EDTAEDTA，EG

14、TAEGTA）、还原剂（）、还原剂（DTTDTT，巯基乙醇）和脂类，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。2、Bradford法蛋白定量法蛋白定量考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。原理：染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小

15、时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。3、Lowery法蛋白定量法蛋白定量Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法。原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，

16、要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。DC Protein Assay免疫印迹（免疫印迹（WesternBlot）二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一一抗孵育抗孵育封闭封闭转膜转膜SDS-聚丙烯聚丙烯酰胺电泳酰胺电泳蛋白变性蛋白变性显影显影五、蛋白质变性2SDS电泳上样缓冲液：1MTris-base(pH6.8)2.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。总体积：10ml加一倍体积的上样缓冲液，95左右加热左右加热5-10min5-10min六、六、SDS-SDS-聚丙烯酰胺

17、凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDS）是一种离子性的界面活性剂是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链酸根离子也带有疏水性的长碳链.当当 SDS 与蛋白质混合时与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用而以硫酸根离子外露与水分子作用.蛋白质结合固定比例之蛋白质结合固定比例之 SDS 後後,由於由於 SDS 带强负价带强负价,使蛋白质原先的带使蛋白质原先的带电价微不足道电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致且

18、每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density),所以决所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。1、原、原 理：理：2 2、SDS-SDS-蛋白质复合物的特点蛋白质复合物的特点（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒。（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的。（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。3 3、支持体：聚丙烯酰胺（、支持体：聚丙烯酰胺（AcrAcr和和BisBis）聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和丙烯酰胺和N N，N N亚甲基双丙烯酰亚甲基双丙

19、烯酰胺胺聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的聚合而成的大分子。凝胶的网状结构是带有酰胺侧链的碳碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。比较小，不易和样品相互作用。在水溶液中，单体和交联剂通过在水溶液中，单体和交联剂通过自由基自由基引发的引发的聚合反应聚合反应形成凝胶形成凝胶 。常用的引发剂和加速剂是常用的引发剂和加速剂是过硫酸氨过硫酸氨(AP)(AP)和和 N N，N N，N N，N-N-四甲基对乙二胺四甲基对乙二胺(TEMED)(TEMED)。浓度可在浓度可在7.5%-15%7.5%-15%之

20、间变化。之间变化。温度高聚合快，温度低聚合慢。温度高聚合快，温度低聚合慢。凝胶成份凝胶成份M丙烯酰胺丙烯酰胺(Acr)(Acr)和和N,NN,N-亚甲双丙烯酰胺亚甲双丙烯酰胺 (Bis)(Bis)避光，避光，保存时间保存时间MSDSSDS（十二烷基磺酸钠）（十二烷基磺酸钠）MTris-Cl Tris-Cl 缓冲液缓冲液 MTEMED TEMED 避光避光M过硫酸铵过硫酸铵 保存时间（保存时间（用前加入用前加入）M去离子水（去离子水（ddHddH2 2O O）4、不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶：浓缩效应分离胶：电荷、分子筛效应分离胶浓缩胶胶浓度7.5%4%Tris pH8.94.00Tr

21、is pH6.82.00Acr+Bis4.001.06H2O7.844.84SDS0.080.08TEMED10l10l10%AP用前加200100总体积16ml8ml堆积作用:凝胶浓度较小，孔径较大，pH=6.8负极 （低电导区，高电场强度）慢 GLy-(pI=5.97)中间 Pr-(pI大多接近5)快 Cl-正极 在浓缩胶(pH=6.8)中HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为

22、快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。浓缩效应浓缩效应SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度5、电泳装置Bio-Rad和国产天能和国产

23、天能操作图示操作图示6、灌制、灌制SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶灌制分离胶隔绝空气灌好后一般室温放置灌好后一般室温放置30分钟左右分钟左右灌制浓缩胶灌制浓缩胶插入梳子插入梳子7 7、配胶注意事项、配胶注意事项l过硫酸铵一般现配现用过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在，如连续实验可在4度放置度放置23天。天。配制配制30丙烯酰胺储存液要过滤。丙烯酰胺储存液要过滤。l配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。不均的情况。l要根据要根据温度调整温度调整TEMED或或AP的使用量的使用量。l水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶

24、面不平。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。l插梳子的时候要用力均匀，一次成型。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。l在上样前可在上样前可20V恒压预电泳恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。分钟，可去除泳道中的杂质。8、电泳注意事项、电泳注意事项 原则上每次上样前将原则上每次上样前将蛋白重新煮沸变性蛋白重新煮沸变性。0.75mm厚厚的的SDSPAGE的的10孔孔梳每孔最多可上蛋白体梳每孔最多可上蛋白体积为积为20ul，15孔孔梳每孔最多可上蛋白体积为梳每孔最多可上蛋白体积为10ul。一般的蛋白每孔上样总量为一般的蛋白每孔上样总量为20ug比较适宜比较适宜,特殊蛋白特殊特殊蛋白特殊对待

25、，对待，0.75mm厚度的胶，每泳道厚度的胶，每泳道最高承受能力为最高承受能力为100ug。为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体积为保持条带的美观，不同浓度的蛋白上样导致加样体积不同时，最好用不同时，最好用1的上样缓冲液补平。的上样缓冲液补平。看看溴酚蓝压缩成一条线溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为后把电压调为100V。当溴酚蓝跑至离胶的下面还有当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳时停止电泳。只要被检测蛋白量只要被检测蛋白量占总蛋白的占总蛋白的1/105,即可被检测。即可被检测。9 9、蛋白、蛋白markermarkerNEB蛋白markerBio-rad彩虹marker

26、u在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率。u值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价耦联，电泳时迁移特性可能会发生某些变化，导致一些偏差，不太适合精确定位蛋白。10、胶上蛋白质的检测（染色）、胶上蛋白质的检测（染色）考马斯亮蓝染色银染最小检出量为0.1ug最小检出量为0.1-1ng1、半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液在用缓冲液湿润滤纸之间湿润滤纸之间，电转，电转101030min30min。2、湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液浸泡在转移装置的缓冲液中，电转中，电转45min45

27、min或过夜。或过夜。七、转七、转膜膜蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。膜上。聚丙烯酰胺胶聚丙烯酰胺胶-膜三明治膜三明治半干转半干转 快速，约10-30min湿转湿转 较稳定，250mA，1.5-2h3、半干转仪、半干转仪4、湿转槽、湿转槽MiniTrans-Blotcellcomponents5、三种膜的特点比较、三种膜的特点比较6、转膜注意事项、转膜注意事项u恒流恒流250mA，1.5h-2h，根据，根据所需蛋白的分子量来调节所需蛋白的分子量来调节。u

28、PVDF膜用前先在甲醇中浸泡膜用前先在甲醇中浸泡15秒钟秒钟，然后在转膜液中浸泡，然后在转膜液中浸泡15分钟以分钟以上后方可使用。上后方可使用。u“三明治三明治”的制作需在转膜液中进行，确保各层精确对齐且的制作需在转膜液中进行，确保各层精确对齐且不能留有不能留有气泡气泡，胶靠负极（黑色），膜靠正极（白色）。，胶靠负极（黑色），膜靠正极（白色）。u半干转对胶、膜及滤纸的大小要求比较高，半干转对胶、膜及滤纸的大小要求比较高，滤纸不能大于膜和胶而直滤纸不能大于膜和胶而直接接触接接触，这样会引起短路，湿转的要求不是很高。，这样会引起短路，湿转的要求不是很高。u胶的左右方向要记牢，膜上做好标记胶的左右方

29、向要记牢，膜上做好标记。u为了为了防止过热因而导致在夹层中形成气泡或使凝胶变形防止过热因而导致在夹层中形成气泡或使凝胶变形，条带扭曲，条带扭曲，转移过程应在冷室中进行。转移过程应在冷室中进行。7、转膜后检测、转膜后检测丽春红染色丽春红染色可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照氨基黑染色氨基黑染色不可逆不可逆，灵敏度为，灵敏度为30ng/条带条带印度墨汁染色印度墨汁染色不可逆不可逆，灵敏度为，灵敏度为6ng/条带条带胶体金染色胶体金染色灵敏度最高，灵敏度最高，400pg/条带条带八、免疫学检测八、免疫学检测l脱脂奶粉（脱脂奶粉（5）lBSA（3%）lWestern Bl

30、ot 膜封闭液（生物试剂公司提供）膜封闭液（生物试剂公司提供）2、封闭液1、洗膜 TBST：Tris-base 2.42 g（pH 7.6），NaCl 8.0 g，Tween-20 1ml，定容至1000ML 3 3、封闭注意事项、封闭注意事项l封闭的作用是封闭的作用是封闭膜上非特异性位点封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结，防止抗体非特异性地结合在膜上。合在膜上。l可可4 4度过夜或在常温度过夜或在常温1-3h1-3h。l尼龙膜及尼龙膜及PVDFPVDF膜可适当延长封闭时间膜可适当延长封闭时间。l奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需w

31、esternwestern的蛋的蛋白时，则不能用其作为封闭液。白时，则不能用其作为封闭液。l也可用也可用3%BSA3%BSA封闭。封闭。ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent4、免疫学反应抗体：单克隆抗体，多克隆抗体一抗：种族特异性：H,R,M，来源:兔源，小鼠源，鸡源二抗：羊抗兔，兔抗小鼠，驴抗兔酶偶联：AP、HRPProteinPrimaryAntibodyE EE ESecondaryAntibody5、多克隆抗体p 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是

32、免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。p抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。p由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，p机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。6、单克隆抗体抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体

33、基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞即具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。7、一抗、二抗孵育、一抗、二抗孵育l将膜放在将膜放在密闭塑

34、料袋密闭塑料袋或者培养皿中，根据或者培养皿中，根据膜面积以膜面积以0.1ml/cm20.1ml/cm2的量加的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。入加入一抗溶液与滤膜温育。37 2-437 2-4小时或小时或4 4 过夜过夜。l用用TBSTTBST洗液洗膜洗液洗膜3 3次次，每次，每次5-10min5-10min。l加入用加入用TBSTTBST配制的二抗配制的二抗，摇床上缓慢摇动，摇床上缓慢摇动，常温常温1 1小时小时。l用用TSTTST洗液洗膜洗液洗膜3 3次次，每次，每次10min10min。抗体的结合抗体的结合l常用抗体品牌：CellSignaling，R&D，Chemicon，Rocklan

35、d，BD，Santa-cruz，Sigma。l抗体需分装，冰冻保存，避免反复冻融。l一般抗体可反复使用两次（一周内）。l抗体浓度过低则检测不出条带，但浓度高了也不行，一抗浓度过高易产生杂带，二抗浓度过高易发生背景，要在“平衡木”上保持平衡，找到一个平衡点。l也可用洗脱液的盐离子浓度高低、洗膜时间长短，及洗膜力度的大小来调节抗体的结合程度。8、二抗与底物显色反应、二抗与底物显色反应l辣根过氧化物酶法（辣根过氧化物酶法（HRP）10-20pgl碱性磷酸酶法（碱性磷酸酶法（AP）10-50pgl化学发光显色法化学发光显色法9、显色反应、曝光、显色反应、曝光我们通常使用的试剂盒是我们通常使用的试剂盒是

36、Amersham Amersham 的的ECL plusECL plus。新鲜配制发光工作液，新鲜配制发光工作液，A A：B B为为4040：1 1用镊子取出膜，搭在用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。小心在膜上。小心在膜上滴加滴加ECLECL混合液，孵育混合液，孵育3-53-5分钟，立即压片曝光，正常强度时肉眼可见分钟，立即压片曝光，正常强度时肉眼可见荧光。荧光。将将膜沥干发光液膜沥干发光液后，夹入后，夹入塑封膜塑封膜，置于压片盒中（内贴增感屏），黑，置于压片盒中（内贴增感屏），黑暗中取出胶片，剪至合适大小，压片，时间长短视荧光强弱而定，也暗中取出

37、胶片，剪至合适大小，压片，时间长短视荧光强弱而定，也可根据第一张胶片曝的效果来调整第二张的压片时间。可根据第一张胶片曝的效果来调整第二张的压片时间。长时间曝光或蛋白过量长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系。10、显影、定影、显影、定影l黑暗状态下黑暗状态下,取出胶片取出胶片,放入显影液放入显影液,当胶片上出现条带后当胶片上出现条带后,掌握火掌握火候将胶片迅速取出候将胶片迅速取出,用水漂洗后放入定影液定影用水漂洗后放入定影液定影.l显影时间要适度显影时间要适度,时间短了条带不清晰时间短了条带不清晰,时间长了易使条带灰度饱时间长了易

38、使条带灰度饱和而使差异消失和而使差异消失,同时同时,背景和杂带也会加深背景和杂带也会加深.l定影时间要充分定影时间要充分,这样可以得到背景比较干净这样可以得到背景比较干净,透明的胶片透明的胶片,且易且易于保存于保存,条带可以长久保持清晰条带可以长久保持清晰.九图片实例解析九图片实例解析目的蛋白参照蛋白p-目的蛋白目的蛋白1、灰度分析、灰度分析剪取条带灰度分析计算比值2、对蛋白质水平和活性的检测、对蛋白质水平和活性的检测对蛋白质含量的检测：对蛋白质含量的检测：Akt，JNK，c-Jun，IRS-1，蛋白质水平内参：蛋白质水平内参：-Actin，GAPDH，-tublin对蛋白质活性的检测：对蛋白质活性的检测：p-Akt473，p-Akt308，p-JNK，p-c-Jun，p-IRS，对蛋白质相互作用的检测对蛋白质相互作用的检测：对蛋白质亚细胞定位的检测对蛋白质亚细胞定位的检测：BCL2，（膜转位、核转位和线粒体转位）（膜转位、核转位和线粒体转位）十 Western Blot常见问题分析问题分析问题分析1问问题题分分析析2问题分析问题分析3问题分析问题分析4免疫相关实验技术免疫相关实验技术l免疫印记免疫印记l免疫共沉淀免疫共沉淀免疫印记免疫印记l染色质共沉淀染色质共沉淀CHIPPCRl免疫组化免疫组化l细胞免疫荧光细胞免疫荧光Thank you for your attention!