《色层分析法》PPT课件.ppt

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1、4.5 薄层层析法及其实验技术薄层层析法及其实验技术l4.5.1 技术参数l4.5.2 理论基础l4.5.3 薄层层析固定相选择原则l4.5.4 薄层层析展开剂选择原则l4.5.5 薄层层析的实验技术l4.5.6 应用技术提提 纲纲薄层层薄层层析法析法快速快速分离效分离效率高率高灵敏灵敏度高度高显色方显色方法多法多应用应用面广面广10-60min塔板塔板数高数高0.01g薄层层析法特点薄层层析法特点4.5.1 技术参数1)1)比移值比移值比移值比移值RfRf 在薄层层析分离中，原点距展开剂前缘的距离为12cm，原点距展开斑点A.B的距离各为6cm.8cm。A.B两斑点的比移值各为多少？RfA=

2、6/12=0.50 RfB=8/12=0.67一对斑点层析时移动距离的差值与两个斑点底宽和的比值的2倍。2)2)分离度分离度分离度分离度RsRs3)3)分离数分离数分离数分离数SNSNa为Rf=1及Rf=0两种组分斑点中心距离W1/20为Rf=0 的组分斑点宽度的1/2W1/2为Rf=组分斑点宽度的1/2 什么是相对比移值（Rf)，他如何测定？代表了什么？为什么可以利用它来进行定性鉴定？思考题 展开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、黏度及吸附剂的种类，粒度，均匀度等因素有关，即和层析系统（包括固定相和流动相两方面）有关，但也和展开距离有关。4.5.2 理论基础理论基础溶剂在薄层中的流速问题溶

3、剂在薄层中的流速问题L2=k t,V=dL/dt=k/2L 1、在薄层层析过程中为什么不讨论平均塔板高度与展开剂流速间的关系，而是讨论与展开距离间的关系？2、设用一定的层析系统进行薄层层析分离时，展开剂前缘移动5cm需要5min。如果展开剂前缘移动10cm层析可以结束，需要多少时间？在展开剂前缘离原点5cm和10cm处，展开剂前缘的上升速度分别为多少？思考题思考题 何种层析(吸附、分配、亲和、凝胶）被分离组分性质（极性、离子、分子 大小等）吸附剂吸附性能强弱 4.5.3 薄层层析固定相选择原则选择原则选择原则固定相性质被分离物质酸碱性活性 分离机制硅胶酸性有吸附/分配 几乎所有物质氧化铝碱性有

4、吸附碱性物质（生物碱）和固醇类硅藻土中性无分配糖类、药物氢氧化钙碱性弱吸附类胡萝卜素、维生素E类磷酸钙弱碱性有吸附类胡萝卜素、维生素E类硫酸钙酸性弱吸附脂肪酸、甘油酸纤维素粉中性无分配染料、氨基酸离子交换剂酸或碱离子交换核酸类及其衍生物葡聚糖凝胶中性排阻作用蛋白质、核酸常用固定相常用固定相l吸附层析展开剂对被分离组分有一定的溶解度展开剂对被分离组分有适当的亲和力展开剂极性一般比被分离物质的极性略小l分配层析展开剂选择各组分溶解度相差大的溶剂 4.5.4 薄层层析展开剂选择原则l制备薄层板：干板-软板，湿板-硬板 定性定量时薄层厚度为 制备薄层的厚度要求约为0.5-2mm 4.5.5 薄层层析的

5、实验技术 活化 形式：硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶HF360 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显色剂；淀粉：不能用于分离有机物）硅胶硅胶l混合薄层：两种不同吸附剂l酸碱薄层：稀酸或稀碱代替水l络合薄层：加入络合剂l涂布固定液的薄层：l具有浓缩区的薄层：不同粒度l高效薄层：极细均匀的吸附剂 1、层析用硅胶，有硅胶G、硅胶H、硅胶GF254、硅胶HF360等等不同标号，这些分别表示什么？应用这些硅胶时应分别注意些什么？2、聚酰胺薄层的作用机理是什么？3、试比较软板和硬板的优缺点。4、简述混合薄层、酸碱薄层、络合薄层、涂布固定液的薄层、具有浓缩区

6、的薄层、高效薄层的分离原理。思考题思考题l点样：溶解试样的溶剂，点液集中，点量精确，点样量适当l展开：极性增强顺序：石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸 原则：先用单一溶剂，再用混合溶剂在硅胶薄层上分离生物碱：单一溶剂：环己烷、苯、氯仿 混合溶剂：苯-氯仿（9：1，1：1）环己烷-氯仿-二乙胺（5：4：1）苯-乙酸乙酯-二乙胺（7：2：1）苯-正庚烷-氯仿-二乙胺（60：50：10：0.2）二乙胺：改变极性，调整酸碱度，增大试样的溶解度 聚酰胺薄层聚酰胺薄层 展开剂洗脱能力的大小顺序：水乙醇甲醇丙酮稀氢氧化铵（钠）溶液甲酰胺二甲基甲

7、酰胺 在聚酰胺薄层上用混合展开剂：水-乙醇（1:1）水-甲醇（1:1）水-乙醇-乙酰基丙酮（4:2:1）水-乙醇-丁酮-乙酰基丙酮（13:3:3:1）水-乙醇-乙酸-二甲基丙酰胺(6:4:2:1)二甲基甲酰胺-苯（3:97）数值分析方法数值分析方法 用56种展开剂分离22种磺胺类药物时，可较快地找到最佳 系统组合 展开方式展开方式上行展开上行展开 下行展开下行展开 径向展开径向展开 多次展开多次展开 连续展开连续展开 双向展开双向展开程序控制多次展开法程序控制多次展开法氯仿氯仿-甲醇（甲醇（95：5）为展开剂分离麦角生物碱）为展开剂分离麦角生物碱氯仿：极性较弱，沸点较低氯仿：极性较弱，沸点较低

8、边缘效应l思考题1、怎样选择薄层层析的展开剂？应该怎样来考虑？2、新发展的薄层技术有哪些？3、用Al2O3薄层层析分离并测定氨基蒽醌中的-氨基蒽醌时，用环己烷-丙酮(3:1)的混合溶剂为展开剂。你认为下列三种溶剂中选用哪一种来溶解试样最为合适？为什么？吡啶、二氧六烷、丙酮，他们的沸点分别为116C，101 C，56 C，溶剂的极性和试样在他们之中的溶解度都依次递减。显色：在紫外光下观察，以蒸汽熏，喷以各种显色剂以及生物自显影 l定性：比移值，斑点的显色特性，斑点的原位光谱扫描，与其他分析技术的联用 l定量：目视比较半定量法，洗脱法（误差约为1-5%），薄层扫描仪l瑞士瑞士CAMAG9(CAMA

9、G9(长玛长玛)公司公司,质量优异质量优异,价格昂贵价格昂贵,主流薄层色谱扫描仪主流薄层色谱扫描仪为为SCANNER-SCANNER-。l日本日本SHIMADEU(SHIMADEU(岛津岛津)公司销售量公司销售量大大,其主流扫描仪为其主流扫描仪为CS-9300CS-9300、CS-9301CS-9301。l上海科贺生化技术有限公司是国上海科贺生化技术有限公司是国内唯一的薄层色谱扫描仪生产厂内唯一的薄层色谱扫描仪生产厂商商 TLSeeTLSee薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪全自动展开仪全自动展开仪 ADC2(瑞士瑞士)全自动控制薄层活化、预平衡，展开缸饱和，展开距离及干燥等所有展开步骤，实时监控并

10、报告展开温度及湿度 l一束光线的波长S是被测物的吸收峰所在；另一束光线的波长R是被测物不吸收的，可使由于薄层不均匀所引起的基线波动得以消除l由于斑点中被测组分的分布是不均匀的，一般是斑点中心被测组分较多，周围较少，因此采用微小光束，曲折形的扫描方式 l采用背景补偿来消除铺薄层所用的吸附剂中可能含有杂质和显色不均匀性的影响l散射参数校正后吸光度和浓度之间成线性关系 l在医药方面的应用在医药方面的应用 4.5.6 应用技术聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜苯苯-甲醇甲醇-丁酮丁酮-甲酸（甲酸（7：1：1.5：0.5）为展开剂）为展开剂分离了分离了7种黄芩中种黄芩中8种黄芩种黄芩苷及苷元苷及苷元人参皂苷的分离图谱

11、人参皂苷的分离图谱 四环素中差向四环素的含量应低于一定标准，因为后者毒性较大。溶四环素试样于甲醇中配成一定浓度的溶液，取一份点于硅藻土薄层上，用丙酮-氯仿-乙酸乙酯（3：1：1）的混合溶剂为展开剂展开后，用浓氨水熏，然后在254nm的紫外光下观察，除四环素主斑点外不得出现差向四环素的杂质斑。产品质量控制及杂质检验产品质量控制及杂质检验 反应终点的控制反应终点的控制未知物结构剖析未知物结构剖析在薄层上分离良好的层析条件，在薄层上分离良好的层析条件，对于柱层析是很有参考价值的。对于柱层析是很有参考价值的。也可用薄层分离制备成品，把粗也可用薄层分离制备成品，把粗制品点在较厚、较大的制备型薄制品点在较

12、厚、较大的制备型薄层板上分离杂质，可达到制备纯层板上分离杂质，可达到制备纯品的目的品的目的 柱层析保持层析过程于低保持层析过程于低温或高于室温的温温或高于室温的温度下进行度下进行粒径越小，理论板粒径越小，理论板高值降低高值降低;粒径越小会降低流粒径越小会降低流速速极细固定相，极细固定相，宜用直径与长宜用直径与长度比例大的层度比例大的层析柱析柱Rs正比于正比于n，也正比于，也正比于L;柱长增加使流速减慢柱长增加使流速减慢;峰宽度峰宽度正比于正比于L;柱的直径大小与板高柱的直径大小与板高H没没有直接关系有直接关系,影响柱效影响柱效.除去蛋白质中的除去蛋白质中的盐及小分子物质盐及小分子物质 Seph

13、adex G-25Bio-gel P30 大黄大黄70%甲醇提取液加到凝胶甲醇提取液加到凝胶色谱柱上，并用色谱柱上，并用70%的甲醇洗的甲醇洗脱，依次得到二蒽酮苷、蒽醌脱，依次得到二蒽酮苷、蒽醌二葡萄糖苷、蒽醌单糖苷、游二葡萄糖苷、蒽醌单糖苷、游离苷元离苷元弱极性的大孔树脂，用弱极性的大孔树脂，用水将糖等亲水性成分洗水将糖等亲水性成分洗脱，用不同浓度的乙醇脱，用不同浓度的乙醇洗下被大孔树脂吸附的洗下被大孔树脂吸附的苷类苷类 XDA大孔吸附树大孔吸附树脂脂,用用85乙醇洗乙醇洗脱，可用于咖啡脱，可用于咖啡碱的吸附分离碱的吸附分离 纸层析l分配层析：67%键合水l滤纸要求：物理性状均匀展开速率均匀；一定的机械强度防变形；一定的纯度，定性灰分0.1%，定量灰分0.05；不与被分离组分反应；层析点圆整；不选高沸点有机溶剂，影响展开后干燥。氨基酸的分离和检出:用酚-水（7：3）作展开剂进行第一次展开；用丁醇-醋酸-水（4:1:2）做展开剂进行第二次展开。展开后用茚三酮的丁醇溶液，使之显色。