生长因子受体对敏感性相关的基因突变研究_薛琴琴.pdf

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1、宫颈癌组织表皮生长因子受体对 TKI 敏感性相关的基因突变研究 薛琴琴1,2，张 菊3，俞青苗1，金 雯1，杨 梅1，刘宁侠1，高艳娥1（1.西安交通大学医学院第二附属医院妇产科，陕西西安 710004；2.榆林市第一医院妇产科，陕西榆林 719000；3.第四军医大学药学系基因所，陕西西安 710032）摘要：目的 研究宫颈癌组织表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因中是否存在与 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)药物敏感性相关的 18、19 及 21 外显子突变，为本地区宫颈癌

2、的靶向治疗提供依据。方法 收集 70 例宫颈癌患者的新鲜癌组织标本，提取 DNA，以特异性引物PCR 扩增 EGFR 基因外显子 18、19 及 21，进行 DNA 测序并分析序列相似性。结果 70 例宫颈癌组织提取质量良好的 DNA 中，均未检测到 EGFR 基因 18、19 及 21 外显子突变。结论 宫颈癌组织 EGFR 基因外显子 18、19 及 21 突变罕见。关键词：宫颈癌；表皮生长因子受体；基因突变；多聚酶链式反应；DNA 测序 中图分类号：R737.33 文献标志码：A 文章编号：1671-8259 EGFR TKI-sensitive gene mutation in cer

3、vical cancer XUE Qin-qin1,2,ZHANG Ju3,YU Qing-miao1,JIN Wen1,YANG Mei1,LIU Ning-xia1,GAO Yan-e1(1.Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University,Xian 710004;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Yulin First Hospital,Yulin 719000;

4、3.Institute of Gene Diagnosis,Department of Pharmacology of Fourth Military Medical University,Xian 710032,China)ABSTRACT:Objective To detect whether in epidermal growth factor receptor(EGFR)there exists mutation of exons 18,19 and 21 associated with tyrosine kinase inhibitor(TKI)medication-sensitiv

5、ity in cervical cancer patients for the purpose of 收稿日期：2011-11-12 修回日期：2012-03-29 通讯作者：高艳娥，教授，E-mail: 作者简介：薛琴琴，在职硕士研究生，E-mail: 网络出版时间：2012-04-28 15:59网络出版地址：http:/ evidence for targeting treatment of cervical cancer in the region.Methods Fresh tissue specimens were collected from 70 patients with c

6、ervical cancer and DNA was extracted from these specimens.Exons 18,19 and 21 of EGFR were amplified with designed specific primers and DNA templates extracted from cervical cancer tissues.Then,the PCR products were sequenced on DNA sequencer,and the sequences were BLAST analyzed.Results No mutations

7、 were detected in exons 18,19 or 21 of EGFR in the 70 human cervical cancer samples analyzed.Conclusion Mutations in exons 18,19 and 21 of EGFR are very rare in cervical cancer.KEY WORDS:cervical cancer;epidermal growth factor receptor;gene mutation;polymerase chain reaction(PCR);DNA sequencing 宫颈癌是

8、危害女性健康的第二位常见肿瘤，每年造成30万人死亡，是造成发展中国家女性死亡的主要原因之一1。宫颈癌治疗后复发是宫颈癌治疗的难题，复发性宫颈癌的首选治疗方法仍是铂类化疗为主的综合治疗2。但此类患者对铂类为主的化疗总有效率只有20%30%3-4。因此，迫切需要探寻复发性宫颈癌患者的有效治疗方案。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的高表达使肿瘤细胞处于活化状态，促进肿瘤细胞增殖、粘附、转移及侵袭，是肿瘤发生发展的原因之一5。在非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma,NSCLC）的治疗中，以 EGFR 为靶

9、点的药物，如 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)已显现出显著的抗肿瘤疗效，而 90%以上的 EGFR 基因 TKI 敏感性突变发生在外显子 18、19 及 21，存在这些突变的 NSCLC 患者对靶向于 EGFR的 TKI 药物吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）治疗敏感性明显增加6-7。而目前对宫颈癌组织中是否存在与 TKI 药物敏感性相关的 EGFR 基因突变尚无定论，本研究旨在探讨本地区宫颈癌组织中 EGFR 外显子 18、19 及 21 突变情况，为宫颈癌靶向治疗提供依据。1 材料与方法 1.1 研究对象

10、选择 2010 年 2 月至 2011 年 1 月在西安交通大学医学院第二附属医院阴道镜下接受宫颈活检及住院接受手术的宫颈癌患者为研究对象，收集宫颈癌组织标本，取材均获得患者的知情同意。采集标本时取 2 份组织块，1 份行病理学检查确定宫颈癌的诊断，1 份置入-40冷冻保存备检。同时收集所有患者的临床资料。1.2 宫颈癌组织 DNA 提取 宫颈癌组织 DNA 的提取参照所用的天根生化科技（北京）有限公司基因组 DNA 提取试剂盒说明书进行。取已研磨好的宫颈癌组织 300L 置入 Eppendorf 管，12000r/min 离心约 1min，吸弃上清。加入 200L缓冲液 GA，振荡 15s

11、混匀。加入 200L 的蛋白酶 K，振荡 15s，56过夜消化组织至组织溶解。组织消化后见 Eppendorf 管内液体清亮，然后再加入 200L 裂解液 GB，振荡混匀，70水浴 20min。后加入 200L 无水乙醇，振荡 15s，将所得的混合液体全部转移到吸附柱中，12000r/min 离心 30s，弃滤液。在吸附柱中加入 500L 缓冲液 GD，12000r/min 离心 30s，弃滤液。继续加入 700L 漂洗液 PW，12000r/min 离心 30s，弃滤液。再次加入 500L 的漂洗液 PW，12000r/min离心，弃滤液。12000r/min 空甩 2min，将吸附柱换入干

12、净的 Eppendorf 管中，室温晾 30min。向膜中央部分加入 100L 预热的洗脱缓冲液 TE，静置 2min，12000r/min 离心 2min，将洗脱液收集到 Eppendorf 管中。重复上述步骤，再洗脱1 次。测取 DNA 洗脱液 A260 和 A280 值，得出 DNA 纯度和浓度，-70保存备用。1.3 EGFR 外显子 18、19 及 21 PCR 引物的设计与合成 根据 Genbank 公开发表的人 EGFR 基因序列(编号 NG_007726)，利用 DNAStar 软件设计 EGFR 基因18、19 及 21 外显子 PCR 引物，引物由上海生工生物工程公司合成。

13、PCR 引物序列及片段长度见表 1。表 1 EGFR 外显子 18、19 及 21 PCR 引物序列及片段长度 Tab.1 PCR sizes and primers of exons 18,19 and 21 of EGFR 外显子 正向引物 后向引物 片段长度(bp)18 5-catggtgagggctgaggtga-3 5-ccagagg(a*)ctgtgccagggac-3 199 19 5-gtgcatcgctggtaacatcca-3 5-ggagatgagcagggtctagagca-3 294 21 5-tggcatgaacatgaccctgaa-3 5-cagcctggtcc

14、ctggtgtc-3 295 1.4 EGFR 外显子 18、19 及 21 的 PCR 扩增 以上述获得的宫颈癌组织 DNA为模板，EGFR 外显子 18、19 及 21 的 PCR 引物进行扩增，具体步骤参照北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品PCR试剂盒说明书进行：PCR体系为50L，内含 10PCR 反应缓冲液 5L、dNTP(10 mmol/L)1L、Taq DNA 聚合酶（1U）1L、上下游引物（10umol/L）各 1L、基因组 DNA 5L、去离子水 36L，空白对照中采用去离子水代替组织 DNA。所有 PCR 的循环参数设置均为 94变性 4min，然后 94 20s，57

15、40s，72 30s，共 35 个循环后，72延伸 5min。扩增产物经含溴化乙锭的 15g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.5 PCR 产物序列测定 分别取 EGFR 外显子 18、19 及 21 相应 PCR 产物各30L，由天根生化科技（北京）有限公司 ABI3730XL 测序仪测序。所获序列与GenBank 核酸数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）进行 Blast 比对分析。2 结 果 2.1 临床资料及病理结果 提取癌组织 DNA 质量良好的 70 例宫颈癌患者被纳入本研究。所有患者临床及病理资料收集完整，无严重心肺疾病、肾功能不全等合并症，不伴其

16、他脏器恶性肿瘤。全部患者均不吸烟，为汉族人群，标本采集前均未接受放疗或化疗。患者年龄 2678 岁，中位年龄 47.5 岁；根据国际妇产科联盟（FIGO）宫颈癌分期标准，其中原位癌 7 例；期 8 例；期 46 例；期6 例；期 3 例；肿瘤直径大于 4cm 者 29 例，直径小于 4cm 者 41 例；病理类型：鳞癌 60 例,腺鳞癌 1 例，腺癌 9 例。2.2 宫颈癌组织 EGFR 外显子 18、19 和 21 的 PCR 结果 15g/L 琼脂糖凝胶电泳结果显示外显子 18、19 和 21 的 PCR 片段长度分别为 199bp、294bp 和 295bp（图 1、图 2）。图 1 宫

17、颈癌组织 EGFR 外显子 18 的 PCR 结果 Fig.1 PCR products of EGFR exon 18 in cervical cancer tissues M：D2000 DNA Maker；1-9：为 EGFR 外显子 18 的 PCR 结果（片段长度为 199bp）；B：空白对照。图 2 宫颈癌组织 EGFR 外显子 19、21 的 PCR 结果 Fig.2 PCR products of EGFR exons 19 and 21 in cervical cancer tissues M：D2000 DNA Maker；1-4：为 EGFR 外显子 19 的 PCR 结

18、果（片段长度为 294bp）；5-9：为EGFR 外显子 21 的 PCR 结果（片段长度为 295bp）；B：空白对照。2.3 EGFR外显子18、19和21的PCR产物测序结果 70例宫颈癌组织中EGFR外显子 18、19 及 21 的 PCR 产物经天根生化科技（北京）有限公司 DNA 测序仪测序，所获序列经 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 分析，均未发现任何突变。部分测序结果见图 3、图 4、图 5。图 3 宫颈癌组织EGFR 外显子 18 PCR 产物测序图 Fig.3 Direct sequencing of EGFR exon 18 PCR pr

19、oducts in cervical cancer tissues 图 4 宫颈癌组织EGFR 外显子 19 PCR 产物测序图 Fig.4 Direct sequencing of EGFR exon 19 PCR products in cervical cancer tissues 图 5 EGFR 外显子 21 PCR 产物测序图 Fig.5 Direct sequencing of EGFR exon 21 PCR products in cervical cancer tissues 3 讨 论 随着分子生物学的发展以及对宫颈癌发病机制的深入研究，分子靶向治疗成为复发性宫颈癌治疗中

20、的热点。EGFR基因位于7号染色体的短臂7p12-24区，由28个外显子组成，属于表皮生长因子家族，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因C-erbB-l的表达产物，由1186个氨基酸残基组成，其结构包括3个区：胞外配体结合区、跨膜区和胞内区（含催化TK区域）；EGFR受体与配体结合后形成同源或异源二聚体，引起构象变化，激活胞内TK区域分子磷酸化，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI-3K/AKT）及信号转导和转录激活子（STAT）通路，调节肿瘤生成、细胞增殖、浸润和凋亡抵抗等多个环节5。EGFR在许多肿瘤组织包括宫颈癌中高表达，与肿瘤患者预后不良、无瘤生存期缩短及

21、化疗耐药相关4。以EGFR为治疗靶标的靶向治疗主要集中在酪氨酸激酶编码区域，治疗药物主要以EGFR-TKI为主。文献报道吉非替尼能使NSCLC患者的症状缓解、病灶缩小、生活质量提高、生存期延长6。但TKI的这些疗效主要决定于EGFR酪氨酸激酶编码区域是否存在对TKI敏感的突变位点8-9，NSCLC中90%的EGFR基因TKI敏感突变位点集中在18、19及21外显子上。以 EGFR 为靶点的小分子 TKI 药物对宫颈癌细胞也具有抑制作用及放疗增敏的作用，并对顺铂耐药宫颈癌细胞株有明显的顺铂化疗增敏作用10。GONCALVES 等11研究发现 EGFR-TKI 药物吉非替尼对于晚期宫颈癌具有治疗作

22、用，与铂类等标准化疗药物相比较，吉非替尼具有不良反应轻微和患者易耐受的优点。厄罗替尼联合放化疗可用于局部晚期宫颈鳞癌的综合治疗，患者具有良好的耐受性12。为明确宫颈癌中是否存在类似于 NSCLC 的 TKI 敏感性突变位点，本研究提取陕西西安地区70例宫颈癌组织DNA，经PCR扩增后直接测序，检测EGFR-TKI药物敏感性基因突变，并分析突变与患者临床特征之间的关系。结果在 70 例宫颈癌患者中均未发现EGFR基因外显子18、19及21突变。有研究发现，在NSCLC中 EGFR 基因 TKI 药物敏感性突变的发生率因地域、种族、肿瘤病理类型、是否吸烟以及性别的不同而有所差异13，如不吸烟的女性

23、 NSCLC 腺癌患者突变发生率较高。在卵巢癌中也发现 EGFR 基因 TKI 药物敏感性突变的发生率有种族差异，如在日本卵巢癌患者中的发生率为 23.5%14，在中国卵巢癌患者中却未发现突变15。而目前国内外少见的有关宫颈癌患者 EGFR 基因 TKI 药物敏感性突变的研究中，均未发现相关突变16-18。因此，EGFR-TKI 药物对宫颈癌疗效与EGFR 功能区其他外显子突变或其他机制，尚待进一步研究。参考文献：1KARIMI Z M,BEHTASH N,CHITI Z,et al.Cervical cancer and HPV vaccines in developing countrie

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