细胞工程 (2)幻灯片.ppt

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1、细胞工程第1页，共35页，编辑于2022年，星期一第2页，共35页，编辑于2022年，星期一第一章第一章绪论绪论第二章第二章细胞基本知识概要细胞基本知识概要第三章第三章细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法第四章第四章细胞质膜与细胞表面细胞质膜与细胞表面第五章第五章物质跨膜运输与信号传递物质跨膜运输与信号传递第六章第六章细胞质基质与内膜系统细胞质基质与内膜系统第七章第七章细胞的能量转换细胞的能量转换第八章第八章细胞核与染色体细胞核与染色体第九章第九章核糖体核糖体第第十十章章细胞骨架细胞骨架第十一章第十一章细胞增殖及其调控细胞增殖及其调控第十二章第十二章细胞分化与基因表达调控细胞分化与基因表达调控

2、第十三章第十三章细胞衰老与凋亡细胞衰老与凋亡第3页，共35页，编辑于2022年，星期一细胞生物学教材主编：翟中和 王喜忠 丁明孝细胞生物学电子版教材策划、编写及制作人员：王喜忠 陈建国 丁明孝 乔守怡 翟中和 邹方东 张咏梅 彭 勇 卢智刚 孙玉慧第4页，共35页，编辑于2022年，星期一本章主要内容：第一节细胞工程基础细胞工程基础第二节植物细胞工程植物细胞工程第5页，共35页，编辑于2022年，星期一第一节细胞工程基础细胞工程基础4.1.1细胞基础细胞基础4.1.2细胞工程的概念与内容细胞工程的概念与内容4.1.3细胞与现代生物技术细胞与现代生物技术第6页，共35页，编辑于2022年，星期一

3、4.1.14.1.1细胞基础细胞基础细胞基础细胞基础细胞是生命结构和功能的基本单位，是个体发育和系统发育的基础。第7页，共35页，编辑于2022年，星期一细胞是生命活动的基本单位一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位细胞是有机体生长与发育的基础细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性没有细胞就没有完整的生命第8页，共35页，编辑于2022年，星期一细胞概念的一些新思考细胞概念的一些新思考细胞是多层次非线性的复杂结构体系 细胞具有高度复杂性和组织性细胞是物质（结构）、能量与信息过程精巧结合的综合体 细胞完成各种化学反应；

4、细胞需要和利用能量；细胞参与大量机械活动；细胞对刺激作出反应；细胞是高度有序的，具有自组装能力与自组织体系。细胞能进行自我调控；繁殖和传留后代；第9页，共35页，编辑于2022年，星期一细胞的基本共性细胞的基本共性所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌 蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA 作为遗传信息复制与转录的载体。作为蛋白质合成的机器核糖体，毫无例外地 存在于一切细胞内。所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。第10页，共35页，编辑于2022年，星期一1.1.细胞的全能性细胞的全能性克隆生物技术的基础克隆生物技术的基础细细胞胞全全能能性性（Toti

5、potencyTotipotency）：如果一个细胞含有该生物全套的遗传信息（n或2n），那么该细胞就具有分化发育成一个完整生物个体的潜在的能力。不但有形态建成的全能性，而且有生理代谢的全能性。此理论是现代生物技术，尤其是高等真核生物技术的一大基石。此理论是现代生物技术，尤其是高等真核生物技术的一大基石。2.细胞的生长繁殖 有丝分裂：有丝分裂：结果导致细胞全能性的产生 减数分裂：减数分裂：核相的变化2nn2n，此过程中会产生细胞融合，遗传信息会重组从而产生新的生命。直直接接分分裂裂（无无丝丝分分裂裂）（direct division）：在培养的细胞中常常发生。细胞开始分裂时，细胞核的核仁首先伸

6、长，中部凹陷，最后中间分开，形成两个基本细胞核。在两核中间产生新壁形成两个细胞。结果导致细胞产生不均等分裂，出现变异。3.细胞是一个复杂的有机系统（体系）细胞内诸要素之间相互作用，相互影响，相互依存构成一个完整的有机体系，并与外界相互作用构成更大的系统。4.细胞处于一种运动状态膜是液体，遗传信息在表达，蛋白在合成，各种生化反应在进行。第11页，共35页，编辑于2022年，星期一4.1.2细胞工程的概念与内容I.概念：在细胞水平上进行研究与生产的技术的总称，即细胞工程II.内容：细胞培养、个体克隆、遗传改造III.基本条件：无菌、生长环境可控第12页，共35页，编辑于2022年，星期一4.1.3

7、细胞工程与现代生物技术v是现代生物技术的重要组成部分v基因操作的技术平台v生物产品加工的反应器第13页，共35页，编辑于2022年，星期一第二节植物细胞工程植物细胞工程4.2.1基本概念基本概念4.2.2细胞组织培养技术细胞组织培养技术4.2.3植物细胞反应器植物细胞反应器4.2.4细胞水平的遗传改造细胞水平的遗传改造4.2.5应用应用第14页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.1基本概念基本概念植植物物组组织织培培养养（Plant Plant tissue tissue cultureculture）:将整个植株（plantlet）、器官组织细胞甚至细胞器进行离体的无菌的培养（广义）

8、。诱导愈伤组织进而再增殖分化的培养技术（狭义）。外植体（外植体（Explant Explant）:用于离体培养的植物组织切段。苗培苗培(Plantlet culturePlantlet culture):主要指从无菌种子开始的幼苗和由外植体分化的幼苗培养。组培（组培（Organ CultureOrgan Culture ）:根、茎、叶、花、果实、种子等细胞悬浮培养（细胞悬浮培养（Suspension cell cultureSuspension cell culture ）:液体中分散良好的细胞或小细胞团的培养。次培养（次培养（SubcultureSubculture）:由最初外植体新增殖的组

9、织再进行连续培养。愈伤组织（CallusCallus）:由母体组织脱分化产生的一团不定型的疏松的薄壁细胞。没有明显的器官组织分化。但是细胞大小、形态、液泡化程度、细胞质含量、细胞壁的特性等存在很大的差异。Dedifferentiation:Dedifferentiation:脱分化Redifferentiation:Redifferentiation:再分化第15页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.1基本概念基本概念器器官官建建成成发发生生Organ Organ formation/genesisformation/genesis：愈伤组织分化形成根和芽的过程。胚胚状状体体Embry

10、oid:Embryoid:指在组织和细胞培养中，起源于非合子细胞，经过多次分裂产生的一种与胚相似的结构。人人工工种种子子（Artificial/Synthetic/Man-made/Somatic Artificial/Synthetic/Man-made/Somatic seedseed）：将植物离体培养产生的胚状体（主要指体细胞胚）包裹在含有养分和具有保护功能的物质中形成的在适应条件下能够发芽出苗的颗粒体（狭义）。广义而言，人工种子也包括：（1）经过或不经过适当干燥处理，不经过包裹成球，直接播种发芽的体细胞胚（2）用聚乙烯等多聚物将多个体胚包裹成丙状物（3）将体细胞胚混在胶中，用流质播种法

11、直接播种（4）用凝胶包裹顶芽、腋芽、小鳞茎等。优点：（1）繁殖速度快（2）固定杂种优势（3）可加入农药肥料及激素，人为控制植物的生长发育和抗逆性（4）是植物基因工程和细胞工程应用于生产的桥梁。第16页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.2细胞组织培养技术细胞组织培养技术第17页，共35页，编辑于2022年，星期一植物组织培养技术路线植物组织培养技术路线:培养基与器材准备培养基与器材准备-材料的采集材料的采集(根、茎、叶、花、花粉粒和花药、芽和种子的子叶)制制备外植体与消毒备外植体与消毒接种接种脱分化培养脱分化培养继继代增殖培养代增殖培养再分化培养再分化培养组培苗的练苗组培苗的练苗移栽移

12、栽第18页，共35页，编辑于2022年，星期一培养基（培养基（Media，Foodforcell）植物体内的必要元素大量元素:C、H、O、N、P、S、K、Ca、Mg微量元素:Fe、B、Cu、Zn、Mn、Cl、Mo有利元素:Co、Na、Se、Si、Ga培养基组成培养基组成无机盐：大量元素，微量元素有机附加物：维生素，氨基酸碳源和能源：糖激素：IAA，KT，GA3，ABA，乙烯（两大对立面是植物激素的一大特点）培养基配制（培养基配制（Cooking）常用的培养方法及培养条件常用的培养方法及培养条件固体培养液体培养：静置培养，振荡培养，旋转培养，滤纸培养等环境因子：光、温、水、气、热在基因型及外植体

13、决定后，培养基及培养条件是导致细胞朝那个方向发展的决定因素。实际上是外因和在基因型及外植体决定后，培养基及培养条件是导致细胞朝那个方向发展的决定因素。实际上是外因和内因的关系，在此时，外因成了矛盾的主要方面，有什么外部条件，就会产生什么样的基因表达模式，从内因的关系，在此时，外因成了矛盾的主要方面，有什么外部条件，就会产生什么样的基因表达模式，从而最终决定细胞的发育模式。而最终决定细胞的发育模式。一般来讲，激素是研究人员选择的第一因素。一般来讲，激素是研究人员选择的第一因素。第19页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.3植物细胞反应器植物细胞反应器v利用利用植物细胞反应器植物细胞反应器

14、生产次生代谢产物生产次生代谢产物优优点点：可以实现工厂化生产，不占用农田，细胞生长自动控制和调节；不受地区，季节和气候等自然条件的限制；通过细胞筛选可以寻找新的有用化合物；通过遗传改良，可以大幅度提高有效物质的含量，也可以将某种前体或某种价值较低的化合物转化成价值较高的化合物；通过代谢调控，可以探索新的生物合成路线，从而获取新的有用物质；周期短，节约人力物力。前前提提条条件件：资源匮乏；引种栽培困难；次生代谢产物的化学结构清楚，药效肯定；培养技术可行；经济效益高。第20页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.3植物细胞反应器植物细胞反应器3.2.3.1悬浮培养系统优优点点：能大量提供比较

15、均匀的植物细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模培养，可能成为细胞工程中独特的产业。建立细胞株建立细胞株：扩大培养（种子培养扩大培养（种子培养）：大罐培养（发酵）大罐培养（发酵）：提取和纯化产品。提取和纯化产品。选材，愈伤组织和悬浮细胞的诱导，优良细胞系的筛选及保存，最适生长条件和产量条件的研究。将优良的生产用的细胞株经过几次扩大繁殖，得到大量的培养细胞，为大规模培养时的接种材料。采用成批的，半连续的和连续的培养系统培养细胞。植物细胞大规模培养的产品生产基本过程植物细胞大规模培养的产品生产基本过程基基 本本 步步 骤骤愈伤组织种子培养产品提取发酵纯化生物量或发酵液研发阶段生产阶段下游加工

16、阶段第21页，共35页，编辑于2022年，星期一悬浮培养生产反应器悬浮培养生产反应器搅拌式搅拌式反应器反应器鼓泡式鼓泡式反应器反应器气升式反气升式反应器应器转鼓式反转鼓式反应器应器缺点：生产效率不高，产品积累少第22页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.3.2固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统q固固定定化化细细胞胞培培养养：是是将将植植物物细细胞胞包包埋埋在在惰惰性性支支持持物物内内部部或或贴贴附在其表面进行培养附在其表面进行培养。q细胞固定化培养优点细胞固定化培养优点 i.i.细细胞胞生生长长速速度度慢慢，有有利利于于次次生生物物质质积积累累；ii.ii.易易于于得得到到高高密密度

17、度的的细细胞胞群群体体，并并建建立立细细胞胞间间的的物物理理和和化化学学联联系系；iii.iii.细细胞胞位位置置固固定定，可可以以建建立立物物理理和和化化学学梯梯度度，有有利利于于细细胞胞组组织织分分化化；iv.iv.易易于于控控制制化化学学环环境境，添添加加次次生代谢物的前体；生代谢物的前体；v.v.易于收获次生物质。易于收获次生物质。q固定化细胞反应器：固定化细胞反应器：平床式反应器，柱式反应器平床式反应器，柱式反应器q固定方法固定方法常用的固定剂常用的固定剂：聚炳烯、藻酸盐，角叉藻聚糖，琼脂糖和琼脂。：聚炳烯、藻酸盐，角叉藻聚糖，琼脂糖和琼脂。第23页，共35页，编辑于2022年，星期

18、一平床培养储液罐立柱式培养储液罐固定化细胞泵进液管进液管泵注意产物外分泌与回收第24页，共35页，编辑于2022年，星期一4.2.4细胞水平的遗传改造细胞水平的遗传改造细胞水平的遗传改造方式有细胞水平的遗传改造方式有：杂交、诱变、基因工程1.细胞杂交细胞杂交1.1植物原生质体的制备植物原生质体是除去了细胞壁后的裸露的球形细胞。在遗传操作上：为细胞转化提供良好受体；细胞杂交良好的材料；细胞诱变。机械分离（机械分离（1892-19821892-1982）先质壁分离，然后随机切片。对高度液泡化的细胞有效。产量低，受材料限制，费时费力。酶法分离酶法分离酶：纤维素酶，果胶酶，半纤维素酶。两步法：解离酶与

19、纤维素酶的使用是一先一后，两步紧紧相连。开始用解离酶将细胞解离，然后在纤维素酶的作用将细胞转化成原生质体。一步法：将植物组织直接放入纤维素酶和果胶酶的混合酶液中酶解。第25页，共35页，编辑于2022年，星期一渗透压稳定剂渗透压稳定剂有机：山梨醇，甘露醇，果糖，半乳糖无机：CaCl2，KCl,Ca(NO3)原生质体的培养原生质体的培养特殊性：需渗透压稳定剂；膜的透性强，需要的营养成分更多；脆弱。方法：液体悬浮法；固体培养法（固体平板法，饲养层培养法）；固液结合法。第26页，共35页，编辑于2022年，星期一植物原生质体融合植物原生质体融合A.化学法化学法诱发剂：Na2NO3,溶菌酶，病毒，明胶

20、，高Ca+高PH，盐混合物，PEG，葡聚糖等B.电激融合电激融合交变电场，掩蔽静电荷，形成两极，然后在布朗运动或再给以瞬时高压直流电冲击，穿孔。-+第27页，共35页，编辑于2022年，星期一C.C.融合体的选择融合体的选择互补法：利用两个不同亲本具有不同的生理或遗传特性，在形成杂种细胞时产生的互补作用而进行选择。在特定的培养基上，只有发生了互补作用的杂种细胞才能生长，从而淘汰非杂种细胞。如激素自养型互补，营养缺陷型互补，抗性突变体互补，非等位基因互补等。机械分离法：天然色素标记，荧光色素标记。D.D.杂种细胞的鉴定杂种细胞的鉴定形态学，细胞学，同工酶，生化，分子生物学等。第28页，共35页，

21、编辑于2022年，星期一4.2.5应应用用1.植物遗传改良增加遗传变异花药、小孢子培养-单倍体培养与利用2.资源保存：保存不能正常繁殖的特有基因和基因型珍稀、特殊材料的保存：野外采集的稀有材料本身不能通过有性世代进行繁殖的材料：不育、多倍体杂种、远缘杂交后代材料第29页，共35页，编辑于2022年，星期一3.脱毒、快繁园艺植物的工厂化生产（兰花、康乃馨、菊花、百合、凤仙花、风信子、水仙花等67科近400种）。脱毒培养第30页，共35页，编辑于2022年，星期一4.试管苗产业甘蔗苗工厂林木组培苗工厂集约化生产香蕉苗商业化生产芦荟苗快繁第31页，共35页，编辑于2022年，星期一5.人工种子经济植

22、物快速繁殖，现实的产业，发展极限是人工种子Redenbaugh将人工种子分为四大类：将人工种子分为四大类：i.裸露的或休眠的繁殖体，对种皮要求不严，可直接种植ii.用种皮包裹的繁殖体，聚氧乙烯膜包裹iii.以涂膜水凝胶包裹的胚状体、不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体，可以从中获得多种养分和激素而发芽iv.由Drew提出的液胶包埋系统，含水的繁殖体，如甘薯的体细胞胚。第32页，共35页，编辑于2022年，星期一以胚状体为繁殖体的人工种子物种主要结果胡罗卜有菌条件下发芽成苗苜蓿有菌条件下发芽成苗芹菜有菌条件下发芽成苗柑桔无菌条件下发芽成苗挪威云杉无菌及有菌条件下发芽成苗松树无菌条件下发芽甘薯无菌条件下

23、发芽大豆无菌条件下发芽玉米无菌条件下发芽成苗葡萄无菌条件下发芽成苗鸭茅草无菌条件下发芽成苗橡胶树无菌条件下包裹发芽西洋参无菌条件下发芽成苗刺五加无菌、有菌条件下发芽成苗青扦无菌条件下发芽成苗黄连无菌条件下发芽成苗大麦无菌条件下发芽芥菜无菌条件下发芽成苗四会贡柑无菌条件下发芽成苗小麦无菌有较菌件下发芽番石榴无菌条件下发芽成苗杂交水稻无菌条件下发芽第33页，共35页，编辑于2022年，星期一以微器官为繁殖体的人工种子物种繁殖体主要结果印度桑芽无菌条件下发芽成苗檀香芽无菌条件下发芽成苗花叶芋芽无菌条件下发芽成苗百合小鳞茎无菌条件下发芽成苗直杆桉树侧芽无菌条件下发芽成苗莴苣芽无菌条件下发芽成苗赤桉微芽

24、无菌条件下发芽成苗节草微芽有菌条件下发芽成苗华腺萼木微芽有菌条件下发芽成苗杨树芽无菌及有菌条件下发芽成苗葡萄芽无菌及有菌条件下发芽成苗大花惠兰原球茎无菌及有菌条件下发芽成苗石斛兰原球茎无菌及有菌条件下发芽成苗唐菖蒲球茎无菌及有菌条件下发芽成苗香蕉微芽无菌及有菌条件下发芽成苗茶树微芽无菌及有菌条件下发芽成苗苹果微芽无菌及有菌条件下发芽成苗第34页，共35页，编辑于2022年，星期一6.有用物质的生产与生物转化有用物质的生产与生物转化40年代报道银胶菊组织培养产生橡胶以来，不完全统计，有近300多种有用化合物在组培物中积累等于或超过其原植物的产量。通过外植体、细胞无性系、培养条件等的选择，可大幅度地提高产率。如泛醌10、花青素等均有近10倍的提高。生物转化：生物转化：有机物酯化、皂化、糖基化、羟基化、异构化、甲基化、还原、氧化等。例：毛地黄毒苷异羟基毛地黄毒苷第35页，共35页，编辑于2022年，星期一