细菌内毒素凝胶试验法幻灯片.ppt

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1、细菌内毒素凝胶试验法第1页，共53页，编辑于2022年，星期一一、试验程序一、试验程序 1 1、试验准备：试剂、仪器及用具等；、试验准备：试剂、仪器及用具等；2 2、确定药品细菌内毒素限值（、确定药品细菌内毒素限值（L L）；）；3 3、选择鲎试剂灵敏度（、选择鲎试剂灵敏度（）；）；4 4、计算供试品最大有效稀释倍数（、计算供试品最大有效稀释倍数（MVDMVD）和最低有效浓度）和最低有效浓度（MVCMVC）；）；5 5、鲎试剂灵敏度复核；、鲎试剂灵敏度复核；6 6、药品与鲎试剂相溶性的初筛试验；、药品与鲎试剂相溶性的初筛试验；7 7、供试品干扰试验；、供试品干扰试验；8 8、干扰试验的验证；、

2、干扰试验的验证；9 9、供试品日常的内毒素限量检查、供试品日常的内毒素限量检查第2页，共53页，编辑于2022年，星期一二、实验仪器设备二、实验仪器设备 1 1、分析天平、分析天平 2 2、净化工作台、净化工作台 3 3、电热恒温干燥箱（、电热恒温干燥箱（0 0300300）4 4、电热恒温水浴锅（、电热恒温水浴锅（371371）或干式恒温培）或干式恒温培养器养器 5 5、温度计（、温度计（10011001）6 6、旋涡混合器、旋涡混合器第3页，共53页，编辑于2022年，星期一三、实验材料和器具三、实验材料和器具 1 1、试管架、试管架 2 2、镊子、镊子 3 3、消毒棉球、消毒棉球 4 4

3、、称量瓶、称量瓶(3060mm)(3060mm)5 5、刻度吸管、刻度吸管(1(1、2 2、5 5、1010、15ml)15ml)6 6、各种试管、各种试管(1075mm)(1075mm)7 7、中号金属饭盒、中号金属饭盒 8 8、加样器、加样器第4页，共53页，编辑于2022年，星期一三、实验材料和器具三、实验材料和器具 9 9、移液器或刻度吸管与吸耳球、移液器或刻度吸管与吸耳球 1010、无热原吸头、无热原吸头 1111、酒精灯、酒精灯 1212、打火机、打火机 1313、剪刀、剪刀 1414、砂轮、砂轮 1515、封口膜、封口膜 1616、记号笔或标记纸、记号笔或标记纸第5页，共53页，

4、编辑于2022年，星期一四、实验材料和器具处理四、实验材料和器具处理 凡是与供试品或反应试剂接触的器具必须经凡是与供试品或反应试剂接触的器具必须经除热原处理。除热原处理。1 1、玻璃：饮用水清净控干、玻璃：饮用水清净控干 铬酸洗液浸铬酸洗液浸泡泡4 4小时小时 饮用水洗净洗液饮用水洗净洗液 饮用水浸泡饮用水浸泡3 3次（每次次（每次3030分钟）分钟）纯化水冲洗三次纯化水冲洗三次干燥干燥 装入饭盒装入饭盒 250250干烤至少干烤至少1 1小时小时 自然冷却至室温自然冷却至室温 2424小时内使用。小时内使用。第6页，共53页，编辑于2022年，星期一四、实验材料和器具处理四、实验材料和器具处

5、理 1 1、塑料：饮用水清净控干、塑料：饮用水清净控干 纯化水冲洗纯化水冲洗三次三次 干燥干燥 6%6%双氧水浸泡或环氧乙烷消毒双氧水浸泡或环氧乙烷消毒 密封，备用。密封，备用。但必须经过验证，必须无热原且不干扰细菌内但必须经过验证，必须无热原且不干扰细菌内毒素的检查。毒素的检查。第7页，共53页，编辑于2022年，星期一五、试剂五、试剂 1 1、鲎试剂（、鲎试剂（TALTAL）：）：2 2、细菌内毒素国家标准品（、细菌内毒素国家标准品（RSERSE）：）：3 3、细菌内毒素工作标准品（、细菌内毒素工作标准品（CSECSE）：）：4 4、细菌内毒素检查用水（、细菌内毒素检查用水（BETBET水

6、）：水）：5 5、铬酸洗液：、铬酸洗液：6 6、75%75%酒精：酒精：7 7、供试品：、供试品：第8页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 （一）试验程序：（一）试验程序：内毒素毒素内毒素毒素RSERSE和和CSECSEBETBET水复溶水复溶混匀混匀稀释为稀释为2 2、0.50.5、0.250.25内毒素内毒素标标准溶液准溶液旋涡混合器旋涡混合器混合混合1515分钟分钟鲎试剂鲎试剂TALTALBETBET水复溶水复溶混匀混匀单次管：原安瓿单次管：原安瓿多次管：反应试管多次管：反应试管轻轻转动轻轻转动瓶壁摇匀瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合每步

7、稀释于旋涡混合器混合3030秒秒0.1mlTAL+0.1mlCSE0.1mlTAL+0.1mlCSE（RSERSE），平行），平行4 4管管NCNC：0.1mlTAL+0.1mlBET0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行水，平行2 2管管第9页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验37371,602min1,602min结果判断：反应管缓缓倒转结果判断：反应管缓缓倒转1801800 0阳性（阳性（+）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者）：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性（阴性（-）：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者）：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者实验

8、有效：实验有效：NCNC管全部呈阴性（管全部呈阴性（-）2.0 2.0管全部呈阳性（管全部呈阳性（+）0.25 0.25管全部呈阴性（管全部呈阴性（-）数据处理：灵敏度测定值数据处理：灵敏度测定值c clglg-1-1(X/4)(X/4)XX：为为反反应终应终点点浓浓度的度的对对数数值值（lglg）鲎试剂鲎试剂灵敏度灵敏度标标示示值值有效：有效：2 2c c0.50.5封口，混匀封口，混匀 反应终点浓度是系列浓度递减的内毒反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度第10页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂

9、灵敏度复核试验 （二）试验操作基本程序：（二）试验操作基本程序：1 1、试剂准备：、试剂准备：2 2、调节恒温水浴箱或培养器温度为、调节恒温水浴箱或培养器温度为371371；3 3、制备内毒素标准溶液、制备内毒素标准溶液2 2、0.50.5、0.25 0.25（0.25EU/ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/ml、0.06EU/ml0.06EU/ml、0.03EU/ml0.03EU/ml）；）；试剂名称生产厂家复溶体积或装量 标示灵敏度或效价数量TAL0.5ml/支0.125EU/ml5CSE1.0ml/支20EU/支1BET水30ml/瓶1第11页，共53页，编辑于

10、2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 （1 1）取）取CSECSE一支，用砂轮在安瓿颈上部划痕，用一支，用砂轮在安瓿颈上部划痕，用75%75%酒精酒精棉球擦拭后，折断；棉球擦拭后，折断；（2 2）用刻度吸管或移液器准确吸取）用刻度吸管或移液器准确吸取BETBET水水1.0ml1.0ml加入加入CSECSE安安瓿内，用封口膜封口，于旋涡混合器上混合瓿内，用封口膜封口，于旋涡混合器上混合15min15min，即制成，即制成20EU/ml20EU/ml的内毒素标准溶液；的内毒素标准溶液；（3 3）再将内毒素标准溶液按）再将内毒素标准溶液按20EU/ml2.0EU/ml2

11、0EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU1.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml/ml0.03EU/ml步骤进行稀释；步骤进行稀释；第12页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 1 1）取试管架，将）取试管架，将7 7支稀释管按支稀释管按2.0EU/ml2.0EU/ml、1.0EU/ml1.0EU/ml、0.5EU/ml0.5EU/ml、0.25EU/ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/m

12、l、0.06EU/ml0.06EU/ml、0.03EU/ml0.03EU/ml的顺序编号排入试管架上；的顺序编号排入试管架上；2 2）用刻度吸管或移液器准确吸取）用刻度吸管或移液器准确吸取3.6ml3.6ml、3.0ml3.0ml、3.0ml3.0ml、3.0ml3.0ml、3.0ml3.0ml、3.0ml3.0ml、3.0mlBET3.0mlBET水加入上述水加入上述7 7支支稀释管内；稀释管内；3 3）另取一支刻度吸管或吸头，准确吸取）另取一支刻度吸管或吸头，准确吸取0.8ml0.8ml的的20EU/ml20EU/ml内毒素标准溶液按，加入内毒素标准溶液按，加入3.6mlBET3.6mlB

13、ET水稀释管内，水稀释管内，在旋涡混合器上混合在旋涡混合器上混合30s30s，制成，制成2.0EU/ml2.0EU/ml内毒素素标准液；内毒素素标准液；第13页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 4 4）以后每步稀释需另一支刻度吸管或吸头，）以后每步稀释需另一支刻度吸管或吸头，准确吸取准确吸取3.0ml3.0ml相应浓度的内毒素标准溶液加入相相应浓度的内毒素标准溶液加入相应的应的3.0mlBET3.0mlBET水的稀释管中，在混合器上混合水的稀释管中，在混合器上混合30s30s，同法依次制备成，同法依次制备成1.0EU/ml1.0EU/ml、0

14、.5EU/ml0.5EU/ml、0.25EU/ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/ml、0.06EU/ml0.06EU/ml、0.03EU/ml0.03EU/ml的内毒素标准溶液。如下图所示。的内毒素标准溶液。如下图所示。第14页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml3.6ml1.0ml1.0ml0.4ml0.4ml3.0ml3.0mlBETBET水水CSECSE3.0ml3.0ml3.0ml3.

15、0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml15min15min30s30s30s30s30s30s30s30s30s30s30s30s20EU/ml20EU/ml2.0EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.03EU/ml第15页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 4 4、细菌内毒素（、细菌内毒素（TALTAL）的准备）的准备 （1 1）取

16、）取TAL5TAL5支，用砂轮在安瓿颈部划痕，用支，用砂轮在安瓿颈部划痕，用75%75%的酒精的酒精棉球擦拭后，折断（避免玻璃屑落入安瓿内）；棉球擦拭后，折断（避免玻璃屑落入安瓿内）；（2 2）用刻度吸管或移液器准确吸取）用刻度吸管或移液器准确吸取BETBET水水0.5ml0.5ml沿瓶壁沿瓶壁加入加入TALTAL的安瓿内，轻轻转动瓶壁使内容物全部溶解的安瓿内，轻轻转动瓶壁使内容物全部溶解（避免产生气泡），将复溶后的（避免产生气泡），将复溶后的TALTAL分别吸取移至一玻分别吸取移至一玻璃瓶内混合均匀；璃瓶内混合均匀；第16页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试

17、剂灵敏度复核试验 （3 3）取试管架一个，按）取试管架一个，按0.25EU/ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/ml、0.06EU/ml0.06EU/ml、0.03EU/ml0.03EU/ml、NCNC顺序做标记后，插入顺序做标记后，插入101075mm反应试管，各内毒素浓度平行反应试管，各内毒素浓度平行4管，管，NC平行平行2管；管；（4）用刻度吸管或移液器准确吸取）用刻度吸管或移液器准确吸取TAL溶液溶液0.1ml分分别加入每支反应试管中。别加入每支反应试管中。5、加样：、加样：NC管各加入管各加入0.1mlBET水，其它各反应管分水，其它各反应管分别各加入别各加入

18、0.1ml相应浓度的内毒素标准溶液。如下图。相应浓度的内毒素标准溶液。如下图。第17页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验0.1ml0.1mlTALTALCSECSE0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.03EU/mlNCNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第18页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎

19、试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 6 6、封口：用封口膜封口，或用医用胶布在酒、封口：用封口膜封口，或用医用胶布在酒精灯火焰上通过精灯火焰上通过1 12次后封口，轻轻混匀（避次后封口，轻轻混匀（避免产生气泡），将反应连同试管架放入免产生气泡），将反应连同试管架放入371371恒恒温水浴箱（或将试管直接放入反应器）中，保温温水浴箱（或将试管直接放入反应器）中，保温602602分分钟（保温过程中应避免震动而影响凝胶的形成）。钟（保温过程中应避免震动而影响凝胶的形成）。7 7、结果记录：将反应管从水浴中轻轻取出，缓缓倒、结果记录：将反应管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转转1801800 0,若管

20、内凝胶显示坚实不变形者为阳性，记录为若管内凝胶显示坚实不变形者为阳性，记录为“+”；若管内无凝胶形成，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁；若管内无凝胶形成，或虽有凝胶但不能保持完整，从管壁滑脱者，均判为阴性，记录为滑脱者，均判为阴性，记录为“-”。如下图。如下图。第19页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验+-第20页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验阴性阴性阳性阳性第21页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 8 8、数据处理：、数据处理：（1 1）

21、判断依据：如果最大浓度）判断依据：如果最大浓度2 2的的4 4支管均支管均为阳性，最小浓度的为阳性，最小浓度的0.250.25的的4 4支管均为阴性，支管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为TALTAL灵敏度的的测定值（灵敏度的的测定值（c c）。）。c clglg-1-1(X/4)(X/4)X X：为反应终点浓度的对数值（：为反应终点浓度的对数值（lglg）当当2.02.0c0.5c0.5时，鲎试剂灵敏度标示时，鲎试剂灵敏度标示值值有效。有效。第22页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试剂灵敏度复核试验 （

22、2 2）反应结果：）反应结果：平行管数内毒素标准溶液浓度（EU/ml）NC反应终点浓度X（反应终点浓度）0.250.1250.060.031+-0.06-1.222+-0.125-0.9033+-0.125-0.9034+-0.125-0.903 （3 3）数据处理：）数据处理：c clglg-1-1(X/4)(X/4)lglg-1-1(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4 0.104EU/ml0.104EU/ml第23页，共53页，编辑于2022年，星期一六、鲎试剂灵敏度复核试验六、鲎试

23、剂灵敏度复核试验 9 9、结果判断：、结果判断：c c在在2.02.0c0.5c0.5（0.25EU/ml0.25EU/ml 0.06EU/ml0.06EU/ml）范围内，本批鲎试剂（）范围内，本批鲎试剂（TALTAL）和灵敏）和灵敏度标示值符合规定，应按标示值使用！度标示值符合规定，应按标示值使用！第24页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 1 1、供试品在进行细菌内毒素检查之前，即通过、供试品在进行细菌内毒素检查之前，即通过比较鲎试剂在内毒素水溶液和内毒素供试品溶液比较鲎试剂在内毒素水溶液和内毒素供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是中反

24、应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对细菌内毒素检查有干扰。否对细菌内毒素检查有干扰。2 2、如鲎试剂和供试品有以下改变，则须重新、如鲎试剂和供试品有以下改变，则须重新进行干扰试验：进行干扰试验：（1 1）鲎试剂来源改变；）鲎试剂来源改变；（2 2）鲎试剂的配方和生产工艺的改变；）鲎试剂的配方和生产工艺的改变；第25页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （3 3）供试品来源的改变；）供试品来源的改变；（4 4）供试品的配方和生产工艺的改变。）供试品的配方和生产工艺的改变。3 3、试验程序：、试验程序：（1 1）计算：供试品细菌内毒素限值）计算：供试品细

25、菌内毒素限值L=K/ML=K/M；（2 2）选择：鲎试剂的灵敏度）选择：鲎试剂的灵敏度；（3 3）计算：供试品的最大有效稀释倍数）计算：供试品的最大有效稀释倍数MVD=L/MVD=L/或最低有效浓度或最低有效浓度MVC=MVC=/L=C/MVD/L=C/MVD；第26页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （4 4）根据初筛试验选择：供试品有效稀释倍）根据初筛试验选择：供试品有效稀释倍数（数（MVDMVD）或有效浓度（）或有效浓度（MVCMVC）；）；（5 5）制备：）制备：2 2、0.50.5、0.250.25内毒素水内毒素水溶液溶液EsEs系列；系列；2

26、 2、0.50.5、0.250.25内毒素供内毒素供试品溶液试品溶液EtEt系列；系列；（6 6）反应：）反应：TAL+BETTAL+BET水（水（NCNC）、）、TAL+TAL+供试品溶供试品溶液（液（NPCNPC）各平行）各平行2 2管；管；TAL+EsTAL+Es系列、系列、TAL+Et TAL+Et系列系列各平行各平行4 4管；管；第27页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （7 7）结果判断：）结果判断：NC NC管全部阴性（管全部阴性（-），），NPCNPC管全部阴性管全部阴性(-)(-)；TAL+Es TAL+Es系列：系列：2 2管全部阳性

27、（管全部阳性（+），），0.250.25管管全部阴性（全部阴性（-）；）；TAL+Et TAL+Et系列：系列：2 2管全部阳性（管全部阳性（+），），0.250.25管全管全部阴性（部阴性（-）。）。试验有效。试验有效。第28页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （8 8）数据处理：）数据处理：EsEs系列反应终点浓度几何平均值：系列反应终点浓度几何平均值：Es=lgEs=lg-1-1(Xs/4)(Xs/4)；EtEt系列反应终点浓度几何平均值：系列反应终点浓度几何平均值：Et=lgEt=lg-1-1(Xs/4)(Xs/4)；X X：为反应终点浓度的对数

28、值（：为反应终点浓度的对数值（lglg）；）；供试品在该浓度下无干扰：供试品在该浓度下无干扰：2.02.0Es0.5Es0.5，2.02.0Et0.5Et0.5；若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的若供试品在该浓度下有干扰，选择灵敏度更高的鲎试剂。鲎试剂。第29页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 4 4、干扰试验程序：、干扰试验程序：（1 1）试剂准备：）试剂准备：（2 2）硫酸庆大霉素注射液细菌内毒素限值）硫酸庆大霉素注射液细菌内毒素限值L L为为0.5EU/1000U0.5EU/1000U。试剂名称生产厂家复溶体积或装量 标示灵敏度或效价数量T

29、AL0.5ml/支0.125EU/ml5CSE1.0ml/支20EU/支1BET水30ml/瓶1硫酸庆大霉素注射液20000U/ml1第30页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （3 3）硫酸庆霉素注射液：）硫酸庆霉素注射液：CL 2000U CL 2000U0.5EU/1000 MVD=MVD=80倍倍 0.125EU/ml 0.125EU/ml 或或 C 20000U/ml C 20000U/ml MVC=MVC=250U/ml L MVD 80 L MVD 80第31页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 (4)(

30、4)制备：制备：1 1）2 2、0.50.5、0.250.25（0.25EU/ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/ml、0.06EU/ml0.06EU/ml、0.03EU/ml0.03EU/ml）内毒素水溶）内毒素水溶液液EsEs系列（方法同鲎试剂灵敏度复核中内毒素标准系列（方法同鲎试剂灵敏度复核中内毒素标准溶液的制备）；溶液的制备）；2 2）2 2、0.50.5、0.250.25内毒素供试品溶液内毒素供试品溶液EtEt系列（用供试品稀释液代替系列（用供试品稀释液代替BETBET水对内毒素进行稀释）。水对内毒素进行稀释）。第32页，共53页，编辑于2022年，星期一七、

31、供试品干扰试验七、供试品干扰试验2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml3.6ml3.6ml1.0ml1.0ml0.4ml0.4ml2.0ml2.0mlCSECSE2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml2.0ml15min15min30s30s30s30s30s30s30s30s30s30s30s30s20EU/ml20EU/ml2.0EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/ml0.

32、125EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.06EU/ml 0.03EU/ml0.03EU/ml硫酸庆大霉素注射液硫酸庆大霉素注射液1 1：4040（500U/ml500U/ml）的稀释液的制备）的稀释液的制备 （5 5）TALTAL的准备：同的准备：同TALTAL灵敏度复核中灵敏度复核中TALTAL的准备。的准备。第33页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （6 6）加样：）加样：1 1）NCNC：0.1mlTAL+0.1mlBET0.1mlTAL+0.1mlBET水，平行水，平行2 2管；管；2 2）NPCNPC：0.1mlTAL+0.1

33、ml0.1mlTAL+0.1ml供试品稀释液，平行供试品稀释液，平行2 2管；管；3 3）TAL+EsTAL+Es系列：系列：0.1mlTAL+0.1ml0.25EU/ml0.1mlTAL+0.1ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/ml、0.06EU/ml0.06EU/ml、0.03EU/ml0.03EU/ml内毒素水溶液各平行内毒素水溶液各平行4 4管；管；4 4）TAL+EtTAL+Et系列：系列：0.1mlTAL+0.1ml0.25EU/ml0.1mlTAL+0.1ml0.25EU/ml、0.125EU/ml0.125EU/ml、0.06EU/ml0.06EU/m

34、l、0.03EU/ml0.03EU/ml内毒素供试品溶液各平行内毒素供试品溶液各平行4 4管。管。第34页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （7 7）反应：）反应：371371保温保温602602分钟。分钟。（8 8）数据处理：）数据处理：1 1）判断依据：）判断依据：0.1ml0.1mlTALTALCSECSEBETBET水水0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.03EU/mlNCNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.

35、1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第35页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 0.1ml0.1mlTALTALCSECSE供试品溶液供试品溶液0.25EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.03EU/mlNCNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml第36页，共

36、53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 如果最大浓度如果最大浓度2 2的的4 4支管均为阳性，最小浓度的支管均为阳性，最小浓度的0.250.25的的4 4支管均为阴性，按下式计算：支管均为阴性，按下式计算：EsEs系列反应终点浓度几平均何值：系列反应终点浓度几平均何值：EsEslglg-1-1(Xs/4)(Xs/4)Et Et系列反应终点浓度几平均何值：系列反应终点浓度几平均何值：EtEtlglg-1-1(Xt/4)(Xt/4)X X：为反应终点浓度的对数值（：为反应终点浓度的对数值（lglg）当当2.02.0EsEs0.50.5，2.02.0EsEs0.50.5

37、时，供时，供试品在该浓度下无干扰。试品在该浓度下无干扰。第37页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 2 2）反应结果：）反应结果：平行管数Es系列内毒素浓度（EU/ml）NC反应终点浓度X（反应终点浓度）0.250.1250.060.031+-0.06-1.222+-0.125-0.9033+-0.125-0.9034+-0.125-0.903平行管数Et系列内毒素浓度（EU/ml）NC反应终点浓度X（反应终点浓度）0.250.1250.060.031+-0.06-1.222+-0.125-0.9033+-0.125-0.9034+-0.125-0.903

38、第38页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 3 3）试验有效：）试验有效：NC NC管全部阴性（管全部阴性（-），），NPCNPC管全部阴性管全部阴性(-)(-)；TAL+Es TAL+Es系列：系列：2 2管全部阳性（管全部阳性（+），），0.25 0.25管全部阴性（管全部阴性（-）；）；TAL+Et TAL+Et系列：系列：2 2管全部阳性（管全部阳性（+），），0.25 0.25管全部阴性（管全部阴性（-）。）。试验有效。试验有效。第39页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 4 4）数据处理：）数据处理：EsE

39、s系列反应终点浓度几何平均值：系列反应终点浓度几何平均值：Es=lgEs=lg-1-1(Xs/4)(Xs/4)=lg =lg-1-1(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4 =0.104EU/ml =0.104EU/ml Et Et系列反应终点浓度几何平均值：系列反应终点浓度几何平均值：Et=lgEt=lg-1-1(Xs/4)(Xs/4)=lg=lg-1-1(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.903)/4(-1.22)+(-0.903)+(-0.903)+(-0.90

40、3)/4 =0.104EU/ml =0.104EU/ml 第40页，共53页，编辑于2022年，星期一七、供试品干扰试验七、供试品干扰试验 （9 9）结果判断）结果判断 Es Es和和EtEt分别在分别在2.02.00.50.5（0.25EU/ml0.25EU/ml0.06EU/ml0.06EU/ml）范围内，供试品在该浓度下无干扰。）范围内，供试品在该浓度下无干扰。第41页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 1 1、检查用反应管数量：、检查用反应管数量：供试品管供试品管2 2支；支；阴性对照管阴性对照管1 1支；支；阳性对照管阳性对照管1 1

41、支；支；供试品阳性对照管供试品阳性对照管1 1支。支。第42页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 2 2、检查程序：、检查程序：供试品：按供试品：按MVDMVD稀释稀释供试品溶液；供试品溶液；内毒素：内毒素：BETBET水复溶水复溶稀释为稀释为2 2内毒素水溶内毒素水溶液；液；供试品溶液复溶供试品溶液复溶稀释为稀释为2 2内毒素的供试品内毒素的供试品溶液；溶液；鲎试剂：鲎试剂：BETBET复溶复溶原安瓿或反应管。原安瓿或反应管。第43页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 3 3、检查加样：、检查

42、加样：供试品管NCPCPPC 加样0.1mlTAL0.1ml供试液0.1mlBET水0.1ml2内毒素水溶液0.1ml2内毒素供试品溶液平行管数2111 封口、混合、孵育反应条件 371保温602分钟 结果判断符合规定-+不符合规定+-+需要复测+-+复测符合规定-+复测不符合规定+-+试验无效+试验无效-+试验无效-+-第44页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 4 4、样品检查：、样品检查：（1 1）硫酸庆大霉素注射液细菌内毒素限值）硫酸庆大霉素注射液细菌内毒素限值L L为为0.5EU/1000U0.5EU/1000U。（2 2）根据干扰试

43、验结果，可选择灵敏度为）根据干扰试验结果，可选择灵敏度为0.125EU/ml0.125EU/ml的的TALTAL对硫酸庆大霉素注射液按最大有对硫酸庆大霉素注射液按最大有效稀释倍数进行日常检查。效稀释倍数进行日常检查。第45页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 （3 3）硫酸庆霉素注射液：）硫酸庆霉素注射液：CL 2000U CL 2000U0.5EU/1000 MVD=MVD=80倍倍 0.125EU/ml 0.125EU/ml 或或 C 20000U/ml C 20000U/ml MVC=MVC=250U/ml L MVD 80 L MVD

44、80第46页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 （4 4）制备：）制备：1 1）供试品溶液的制备：如下图。）供试品溶液的制备：如下图。4.0ml4.0ml6.0ml6.0ml3.6ml3.6ml0.4ml0.4ml2.0ml2.0mlBETBET水水4.0ml4.0ml30s30s30s30s2000EU/ml2000EU/ml500EU/ml500EU/ml250EU/ml250EU/ml1 1：10101 1：40401 1：8080硫酸庆大霉硫酸庆大霉素注射液素注射液第47页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、

45、供试品细菌内毒素检查 2 2）2 2（0.25EU/ml0.25EU/ml）内毒素溶液的制备，如）内毒素溶液的制备，如下图。下图。3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml3.6ml3.6ml1.0ml1.0ml0.4ml0.4ml3.0ml3.0mlCSECSE3.0ml3.0ml3.0ml3.0ml15min15min30s30s30s30s30s30s20EU/ml20EU/ml2.0EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.25EU/mlBETBET水水第48页，共53页，编辑于2022年，星期一八

46、、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 3 3）含）含2 2内毒素的供试品溶液的制备，如下图。内毒素的供试品溶液的制备，如下图。2.0ml2.0ml1.0ml1.0ml4.0ml4.0ml4 4CSECSE（0.5EU/ml0.5EU/ml）500EU/ml500EU/ml250EU/ml250EU/ml1 1：40401 1：8080硫酸庆大霉素硫酸庆大霉素注射液注射液2 2CSECSE（0.25EU/ml0.25EU/ml）第49页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 （5 5）鲎试剂准备与灵敏度复核相同。）鲎试剂准备与灵敏度复核相同

47、。（6 6）加样：）加样：供试品溶液供试品溶液0.1ml0.1mlTALTAL0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1mlBETBET水水NCNC0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml2 2CSECSE含含2 2CSECSE供试供试品液品液0.1ml0.1ml供试品液供试品液+0.01ml20+0.01ml20CSECSE供试品管供试品管PPCPPCPPCPPCPCPC第50页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 （7 7）孵育：）孵育：371371保温保温602602分钟。分钟。（8 8）结果判断：）结果判断：1 1）试验有效：）试验有效：NCNC管阴性（管阴性（-）；）；PCPC管阳性（管阳性（+）；）；PPCPPC管阳性管阳性（+）。）。第51页，共53页，编辑于2022年，星期一八、供试品细菌内毒素检查八、供试品细菌内毒素检查 2 2）结果判断：）结果判断：结果判断供试品管NCPCPPC符合规定-+不符合规定+-+需要复测+-+复测符合规定-+复测不符合规定+-+第52页，共53页，编辑于2022年，星期一谢谢！谢谢！第53页，共53页，编辑于2022年，星期一