荧光分析法 (2)幻灯片.ppt

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1、荧荧光分析法光分析法第1页，共29页，编辑于2022年，星期二2008年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（GFP）第2页，共29页，编辑于2022年，星期二green fluorescence protein 科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质科学家在线形虫体内植入绿色荧光蛋白质GFP标记的微管标记的微管第3页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光与荧光分析法荧光与荧光分析法（fluorescene and fluorometry)fluorescene and fluorometry)v荧光荧光（fluorescene):fluorescene):物质分子接受光子能

2、量被激发后，从激发物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低能级返回基态时发射出的光。态的最低能级返回基态时发射出的光。v荧光分析法（荧光分析法（fluorometry)fluorometry)：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度高，检测限达高，检测限达1010-10-10g/ml,g/ml,甚至甚至1010-12-12g/mlg/ml。第4页，共29页，编辑于2022年，星期二电子能级的多重态电子能级的多重态 电子能级的多重度：电子能级的多重度：M=2S+1 S S为电子自

3、旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)M=1，单重态，用，单重态，用S表示（表示（single state）M3，三重态，用，三重态，用T表示（表示（triplet state）能能量量单重基态单重基态激发单重态激发单重态激发三重态激发三重态禁阻跃迁禁阻跃迁第5页，共29页，编辑于2022年，星期二S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光能量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换l l 2体系间跨越体系间跨越振动弛豫振动弛豫内转换内转换第6页，共29页，编辑于2022年，星期二激发态激发态基态基态的能量传递途径的能量传递途径传递途径传递途径辐射跃迁辐

4、射跃迁荧光荧光内转换内转换外转换外转换体系间跨越体系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发发光光强强度相对大。度相对大。荧光：荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态基态磷光：磷光：10-410s，第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态基态磷光磷光第7页，共29页，编辑于2022年，星期二 激发光谱与荧光光谱激发光谱与荧光光谱 excitation spectrum and fluorescence spectrum1.1.

5、荧光荧光(磷光磷光)的的激发光谱激发光谱：固固定定测测量量波波长长,化化合合物物发发射射的的荧荧光光(磷磷光光)强强度度与照射光波长的关系曲线与照射光波长的关系曲线。2.荧光荧光(磷光磷光)的的发射光谱发射光谱：固定激发光波长固定激发光波长,化化合物发射的荧光合物发射的荧光(或磷光强度或磷光强度)与发射光波长关系与发射光波长关系曲线。曲线。第8页，共29页，编辑于2022年，星期二nmF200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱第9页，共29页，编辑于2022年

6、，星期二GFP的激发光谱与荧光光谱的激发光谱与荧光光谱第10页，共29页，编辑于2022年，星期二激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系1.Stokes1.Stokes位移位移 荧光发射波长大于激发波长的现象。荧光发射波长大于激发波长的现象。内转换和内转换和振动弛豫是主要原因。振动弛豫是主要原因。2.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量,产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再跃迁回到基态，产生一个发射带。再跃迁回

7、到基态，产生一个发射带。3.镜像关系镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系。第11页，共29页，编辑于2022年，星期二nm蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）蒽的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）第12页，共29页，编辑于2022年，星期二200250300350400450500 nmFS0S1*V=0V=1V=2V=0V=1V=2b0b1b2c2c1c0 E2 E1 E2 E1b0c0b1b2c1c2镜镜像像关关系系解解释释示示意意第13页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关

8、系 分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件1.具有强的可见紫外吸收具有强的可见紫外吸收(长共轭分子）长共轭分子）2.具有一定的荧光效率（具有一定的荧光效率（f）（刚性平面分子）（刚性平面分子）第14页，共29页，编辑于2022年，星期二长共轭结构长共轭结构 苯苯 萘萘 蒽蒽 ex 205nm 286nm 356nm em 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36维生素维生素A A ex327nm，em510nm 第15页，共29页，编辑于2022年，星期二刚性平面结构刚性平面结构可可降降低低化化学学键键的的旋旋转转，增增加加共共轭轭健健的的共共平平面面

9、性性，使使荧荧光光效效率率增增加加。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素素有有很很强强的的荧荧光光，酚酞却没有。酚酞却没有。第16页，共29页，编辑于2022年，星期二取代基取代基v第一类：增加分子的第一类：增加分子的 电子共轭程度，电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长增长。如使荧光效率提高，荧光波长增长。如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-CN。v第二类：减弱分子的第二类：减弱分子的 电子共轭程度，使荧光减弱电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。如：甚至熄灭。如：-COOH、-NO2、-CO、-X、-NO、-SH。v第三类：第三类：对对 电子共轭作用较小，对荧光

10、的影电子共轭作用较小，对荧光的影响不明显。如：响不明显。如：-R、-SO3H、-NH3+。第17页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光试剂荧光试剂 能与弱荧光物质或无机离子反应生能与弱荧光物质或无机离子反应生成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析法的应用范围。法的应用范围。v荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。v邻苯二甲醛（邻苯二甲醛（OPA）：测定伯胺、）：测定伯胺、-氨基酸。氨基酸。v丹酰氯丹酰氯:测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱v测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂第18页，共29页，编

11、辑于2022年，星期二影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素1.1.温度温度 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，荧光强度对温度变化敏感，温度增加，荧光效率降低。荧光效率降低。2.2.溶剂溶剂 溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成、粘粘度度都都将将使使化化合合物物的的荧荧光光发发生生变变化化。极极性性、粘粘度度增增强强，荧荧光光波波长长长长移移，强强度度增增加。加。3.3.酸度酸度 对对酸酸碱碱化化合合物物，溶溶液液pH的的影影响响较较大大，需需要要严严格格控控制制。不同荧光物质有其最适宜的不同荧光物质有其最适宜的pH值范围。值范围。第19页，共29页，编辑于2022年

12、，星期二影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素4.荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、荧光熄灭剂：重金属离子、卤素离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。羰基和羧基化合物。5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响。瑞利光（瑞利光（Reyleigh scattering light)Reyleigh scattering light)拉曼光拉曼光(Raman scattering light)(Raman scattering light)波波长长比比入入射射光光更更长长的的拉拉曼曼光光 ，对对荧荧光光测测定定的的

13、干干扰扰更大。更大。第20页，共29页，编辑于2022年，星期二aba：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光b：0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光第21页，共29页，编辑于2022年，星期二溶液的荧光测定溶液的荧光测定入射光入射光 I0透射光透射光 I荧光荧光 F F第22页，共29页，编辑于2022年，星期二定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 F正比于吸收的光强度正比于吸收的光强度Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：F=KIa 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-cl)F=K I0(1-10-cl)=

14、K I0(1-e-2.3 cl)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：F=2.3 K I0 cl =Kc注意：当注意：当 cl 0.05时，时，F与与C不成正比。不成正比。第23页，共29页，编辑于2022年，星期二定量分析方法定量分析方法v校正曲线法校正曲线法配制标准溶液系列，分别测定系列中各溶液的配制标准溶液系列，分别测定系列中各溶液的荧光强度荧光强度F F，作校正曲线，作校正曲线F-CF-C图，根据待测溶液的图，根据待测溶液的F Fx x值，在图中求出待测液的值，在图中求出待测液的C Cx x。若空白溶液的荧光若空白溶液的荧光强度不能校正到强度不能校正到0 0，

15、则须作，则须作（F-FF-F0 0）-C-C图。图。第24页，共29页，编辑于2022年，星期二定量分析方法定量分析方法v比例法比例法v联立方程法联立方程法第25页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光计荧光计光光 源源第一单色器第一单色器或滤光片或滤光片样品池样品池检测器检测器第二单色器第二单色器或滤光片或滤光片记录仪记录仪激发激发荧光荧光v滤光片荧光计v滤光片-单色器荧光计v荧光分光光度计氙灯氙灯高压汞灯高压汞灯染料激光器染料激光器光电光电倍增管倍增管第26页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光法应用荧光法应用1.无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有

16、机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 第27页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光法应用荧光法应用2.有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析 荧光分析法主要应用于有机

17、物、生化荧光分析法主要应用于有机物、生化物质、药物的测定（物质、药物的测定（200多种），包括：多种），包括：有机化合物有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。芳烃、氨基酸、蛋白质等。药物药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱等。碱等。维生素维生素如：维生素如：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、叶酸叶酸 等。等。甾体、抗生素、酶、辅酶甾体、抗生素、酶、辅酶 等。等。第28页，共29页，编辑于2022年，星期二荧光分析新技术荧光分析新技术v激光荧光分析激光荧光分析v时间分辨荧光分析时间分辨荧光分析v同步荧光分析同步荧光分析v胶束增敏荧光分析胶束增敏荧光分析第29页，共29页，编辑于2022年，星期二