大肠杆菌表达系统使用指导课件.pptx

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1、（二）融合蛋白技术的内容（二）融合蛋白技术的内容构建融合蛋白的基本原则是，构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的将第一个蛋白的终止密码子删除终止密码子删除，再接上再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的，以实现两个基因的共同共同表达表达。具体步骤有：。具体步骤有：1.进行目的基因的克隆：进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则根据基因序列互补原则 ，设计合适的引物序，设计合适的引物序列，以列，以cDNA为模板，利用为模板，利用PCR技术扩增不同的目的技术扩增不同的目的DNA片段片段。2.在载体中进行重组：在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个通过限

2、制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。测序。4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化 。（三）融合蛋白技术的关键（三）融合蛋白技术的关键在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头

3、序接头序列列(Linker)，即连接肽，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。一般来说，一般来说，3-5 个氨基酸的个氨基酸的Linker 可满足大部分融合可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一有人尝试在融合蛋白间加入一段有段有疏水性和

4、一定伸展性的较长肽链疏水性和一定伸展性的较长肽链，如，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满并获得了满意的结果。意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式，合蛋白时，应多选择几种融合方式，从中优化出理想的从中优化出理想的连接方式。连接方式。另外，大量研究表明另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。白质的功能结构域是十分重要的。常用的融合蛋白的载体有常用的融合蛋白的

5、载体有人血清白蛋白人血清白蛋白(Huma serum albumin，HSA)融合蛋白融合蛋白、-半乳糖苷酶融合蛋白、半乳糖苷酶融合蛋白、谷谷胱甘肽胱甘肽 S-转移酶转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋白融合蛋白以及硫氧还蛋白(Trx)融合融合蛋白等。蛋白等。而人血清白蛋白而人血清白蛋白(HSA)则由于本身特殊的优点，则由于本身特殊的优点，更适合于充当长效融合蛋白类更适合于充当长效融合蛋白类 药物的融合载体。药物的融合载体。HSA是包含是包含585个氨基酸残基的个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质单链无糖基化的球形蛋白质，分子量分子量65kD。它是。它是人血浆中含量最高的单一蛋白质人血浆中含

6、量最高的单一蛋白质(达达40g/L)，在体内有维持血液渗透压，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重运输营养和其它重要生物物质的作用。要生物物质的作用。HSA本身是许多本身是许多内源因子和外源药物内源因子和外源药物的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用的载体。药物和血清白蛋白结合后。可以减少其生物利用度，度，增加在体内的半衰期至增加在体内的半衰期至19d之久。之久。人血清白蛋白融合技术具有明显人血清白蛋白融合技术具有明显 的优点，包括：的优点，包括：HSA与目与目标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，标蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，不需额外的体不需额外的体外处理外处理；

7、HSA表达水平较高，表达水平较高，融合后可以提高融合后可以提高目的蛋白的表目的蛋白的表达水平达水平；HSA是一个稳定的是一个稳定的“惰性惰性”蛋白，蛋白，融合后可以提融合后可以提高目的蛋白的稳定性高目的蛋白的稳定性 ；HAS融合蛋白具有比融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白修饰的蛋白药物更长的半衰期药物更长的半衰期 。（三）细胞因子重组融合蛋白（三）细胞因子重组融合蛋白细胞因子重组融合蛋白是细胞因子重组融合蛋白是一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和一类利用基因工程的方法将编码细胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融合产物其他有特定功能的蛋白分子基因序列连接并表达相应蛋白质融

8、合产物。其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组其结构特点为将细胞因子功能活性域与其他分子的活性域融合，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强。按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、按生物学功能的不同可分为：细胞因子与抗体的融合蛋白、细胞因子细胞因子与毒素的融合蛋白与毒素的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、不同细胞因子的融合蛋白、细胞因子与细胞因细胞因子与细胞因子受体的融合蛋白子受体的融合蛋白以及以及细胞因子与其他分子的融合蛋白细胞因子与其他分子的融合蛋白。这些兼具特。这些兼具特异异

9、 性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床，性与高效性的新型重组融合蛋白有些已走向临床，在抗肿瘤、在抗肿瘤、抗风湿病、抗抗风湿病、抗 HIV感染等领域发挥作用，感染等领域发挥作用，为人类疾病的治疗提供新为人类疾病的治疗提供新的手段。的手段。1、细胞因子与毒素的融合蛋白、细胞因子与毒素的融合蛋白在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体，在一些肿瘤细胞表面存在许多细胞因子受体，可利用细可利用细胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤胞因子作为靶向载体将细胞毒素运送到肿瘤微环境以杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞。白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白白喉毒素与细胞因子的重组融合蛋白便是这样便是这样一类能直

10、接杀伤靶细胞的免疫制剂。一类能直接杀伤靶细胞的免疫制剂。2、细胞因子与细胞、细胞因子与细胞因因 子子受体的融合蛋白受体的融合蛋白通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细通过将在体内发挥作用时相互依赖或者所具有的协同作用细胞因子与细胞因子受体基因重组，胞因子与细胞因子受体基因重组，可大大促进其生物学活可大大促进其生物学活性的发挥。性的发挥。IL-6在肝细胞的增殖中起着增强作用。在肝细胞的增殖中起着增强作用。IL-6和和IL-6R(gp80(gp80)的结合使其易于和另一个受体的结合使其易于和另一个受体IL-6R(gpl30)结合。结合。体系选择体系选择研究基因功能研究基因功能:大肠杆

11、菌大肠杆菌,裂殖酵母裂殖酵母,昆虫细胞昆虫细胞,CHO细胞细胞多肽药物生产多肽药物生产:大肠杆菌大肠杆菌,毕氏酵母毕氏酵母,CHO细胞细胞,乳腺组织乳腺组织疫苗疫苗:大肠杆菌大肠杆菌,酵母酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产单抗生产:杂交瘤细胞杂交瘤细胞工业酶生产工业酶生产:各种微生物各种微生物 按蛋白质类型分 单纯表达单纯表达:pJLA:pJLA系列系列,用用NcoI/NdeINcoI/NdeI导入导入AUGAUG的载体的载体 融合表达融合表达:融合各种融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etctag,GST,CBD,MAL,GFP,etc

12、分泌表达分泌表达:pel/ompT:pel/ompT分泌肽分泌肽按启动子分 laclac及衍生的及衍生的tac,trc,pac,ractac,trc,pac,rac等启动子等启动子 IPTGIPTG诱导诱导 lamda phage Plamda phage PL L和和P PR R 启动子启动子 热热诱导诱导 T7 T7 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 T5 T5 启动子启动子 IPTGIPTG诱导诱导 araara启动子启动子 阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类大肠杆菌表达载体分类pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列 (T7 promoter,Novagen

13、(T7 promoter,Novagen公司公司)pQE系列 (T5 promoter,Qiagen(T5 promoter,Qiagen公司公司)pMAL系列 (周质表达周质表达,BioLabs,BioLabs公司公司)pGEX系列 (GST(GST融合表达融合表达,Pharmacia,Pharmacia公司公司)pBAD系列 (Arabinose(Arabinose诱导型诱导型)常用表达载体常用表达载体pTYB系列 (CBD(CBD融合融合,可以自我切割可以自我切割,BioLabs),BioLabs)Protein A Protein A GSTGST（glutathione S-tran

14、sferaseglutathione S-transferase）CBD(chitin-binding domain,CBD(chitin-binding domain,BioLabs;BioLabs;cellulose-binding domain,cellulose-binding domain,NovagenNovagen)calmodulin-binding domain,calmodulin-binding domain,StratageneStratagene)MBP(maltose-binding protein)MBP(maltose-binding protein)GFP (

15、green fluorescence protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *Thioredoxin *帮助二硫键形成帮助二硫键形成 Dsb(periplasma enzyme DsbA,DsbC)Dsb(periplasma enzyme DsbA,DsbC)*二硫键的形成与二硫键的形成与 SUMO(small ubiquitin-related modifier)SUMO(small ubiquitin-related modifier)KSI(ketosteroid isomerase)KSI(ketosteroid is

16、omerase)基本上全部沉淀基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化His-tag(His-tag(6-8 Histidine6-8 Histidine)T7-tag (T7-tag (MASMTGGQQMGMASMTGGQQMG)HSV-tag(HSV-tag(QPELAPEDPEDQPELAPEDPED)S-tag(S-tag(KETAAKFERQHMDSKETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag(VSV-G-tag(TTDIEMNRLGKTTDIEMNRLGK)HA-tag(HA-tag(YPYDVPDYAYPYDVPDYA)

17、Flag-tagFlag-tag (DYKDDDDKDYKDDDDK)Myc-tag(Myc-tag(EQKLISEEDLEQKLISEEDL)各种用于抗体识别的标记各种用于抗体识别的标记Biotinylation-tag 100100多多AAAA的结构域的结构域,在大肠杆菌中被识别为生物在大肠杆菌中被识别为生物素化的位点素化的位点.Promega.Promega的的PinPointPinPointTMTM Xa-1;Xa-1;InvitrogenInvitrogen的的pET104-DEST.pET104-DEST.未命名未命名 DVEAWLGAR,DVEAWLGAR,被用来和被用来和str

18、eptoavidinstreptoavidin结合结合 (个人通讯个人通讯)未命名未命名 一些病毒外壳蛋白的片段一些病毒外壳蛋白的片段,破坏细胞膜的结构导破坏细胞膜的结构导致容易进入细胞致容易进入细胞有前景的特殊用途的有前景的特殊用途的tagDTT:intein的Cys 溴化氰:MetThrombin:LVPRGS Factor Xa:IEGREnterokinase:DDDDKPreScissionTM protease:LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease:ENLYFQ G融合蛋白的专一性切割融合蛋白的专一性切割 BL21(DE3)/pLysS:

19、BL21(DE3)/pLysS:自身表达自身表达T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase 适用适用pETpET系列等带系列等带T7T7启动子的载体启动子的载体 M15/SG13009:M15/SG13009:自身表达自身表达T5 RNA polymeraseT5 RNA polymerase 适用适用pQEpQE系列等带系列等带T5T5启动子的载体启动子的载体 BL21BL21TrxBTrxB(DE3):(DE3):thioredoxin reductase thioredoxin reductase 突变突变 Origami:Origami:thioredoxin

20、 reductase/glutathione reductase thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变双突变 适合带适合带thioredoxin reductasethioredoxin reductase的融合表达载体的融合表达载体,帮助形成更多的二硫键帮助形成更多的二硫键 BR21CodonPlusRIL:BR21CodonPlusRIL:富含富含ATAT的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达 BR21CodonPlusRP:BR21CodonPlusRP:富含富含GCGC的真核生物基因的表达的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株特

21、殊的表达用菌株NovagenStratageneInvitrogen BioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL重要的原核表达质粒提供商重要的原核表达质粒提供商如果所表达的蛋白质有二硫键并需要正确的立体结构,尽可能进行可溶性表达;如果所表达的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清,采用包含体表达比较好;如果希望表达的多肽的分子量小于10 kDa,一定要进行融合表达采用MBD融合采用GST融合采用CBD融合采用thioredoxin融合采用Origami等宿主菌降低菌体培养的速度 温度温度 (15-30(15-30),),降低转速降低转速

22、让表达产物可溶化让表达产物可溶化采用CBD融合 (pET36/37)(pET36/37)采用Dsb融合 (pET39/40)(pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体 (pET12/20/22)(pET12/20/22)采用带MBD融合(pMAL(pMAL载体载体,Biolabs),Biolabs)采用带SUMO融合 (pET SUMO,Invitrogen)(pET SUMO,Invitrogen)让蛋白质分泌到间质去让蛋白质分泌到间质去纯化方便:先用 EDTA/EDTA/蔗糖蔗糖 溶液处理,然后 5 mM MgSO4 5 mM MgSO4 洗出透析法:简单;但费时,费缓冲液,

23、蛋白质浓度不能过高(容易产生沉淀)快速稀释法:最常用的小规模复性方法;但比较费时,费缓冲液,蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀)超滤透析法:比较省缓冲液,处理量大;但费时,要控制好蛋白质浓度凝胶过滤法:快速,可重复性高,不会产生沉淀,操作复杂一点 亲和层析复性法亲和层析复性法,水相二相法水相二相法,etc,etc包含体来源蛋白质的复性包含体来源蛋白质的复性 表达量不够高；表达量不够高；包含体在包含体在8M8M尿素中不能溶解；尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带带His-tagHis-tag重组蛋白不吸附到重组蛋白不吸附到Ni-chelat

24、ingNi-chelating树脂上；树脂上；Ni-chelatingNi-chelating分离纯化的效果不好；分离纯化的效果不好；GSTGST融合蛋白不吸附到融合蛋白不吸附到glutathione-Sepharoseglutathione-Sepharose上；上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelatingNi-chelating错用错用DTTDTT后发生黑色沉淀该怎么办？后发生黑色沉淀该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？贵重的亲和层析树脂经常发生结块该怎么办？某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高

25、某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高经常碰到的问题经常碰到的问题尝试不同表达载体，特别是N端有融合蛋白的载体是不是酸性蛋白质？是不是蛋白质的合成提前中止了？（富含Arg,Ile,Leu,Pro这几种氨基酸）可以尝试用BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌(Stratagen)；使用C端带His-tag的融合表达载体（如pET21,Novagen）以便纯化全长的融合蛋白His-tagHis-tag被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以被操作过程混入的重金属离子所饱和，可以通过添加通过添加0.5 mM EDTA0.5 mM EDTA来去除重金属离子的干扰；来去除重金属离子的

26、干扰；His-tagHis-tag被包裹在不易和树脂发生结合的被包裹在不易和树脂发生结合的位置（比较位置（比较罕见）罕见）;其他不明原因导致弱其他不明原因导致弱结合结合样品没有很好细心去除不溶性物质样品没有很好细心去除不溶性物质重复使用前树脂没有洗干净重复使用前树脂没有洗干净蛋白质之间存在相互作用蛋白质之间存在相互作用可以提高盐浓度可以提高盐浓度,改变改变pH,pH,添加添加2-6 M2-6 M尿素等方法来尿素等方法来洗去杂蛋白质洗去杂蛋白质样品没有很好细心去除不溶性物质重复使用前树脂没有洗干净蛋白质之间存在相互作用可以提高盐浓度,改变pH,添加2-6 M尿素等方法来洗去杂蛋白质是不是在进行复性时用了Redox buffer 尝试用 Urea gradient /Gel filtration来解决 尽快用尽快用0.1 N HCl0.1 N HCl冲洗冲洗 用用0.1 N NaOH/0.1%SDS0.1 N NaOH/0.1%SDS洗洗主要是溶氧量的问题主要是溶氧量的问题,可以通过在摇瓶中加入不可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积同量的培养基的方式来确定最佳体积