基因组与蛋白质组PPT讲稿.ppt

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1、基因组与蛋白质组第1页，共55页，编辑于2022年，星期六问题问题v细胞周期的不同时期细胞周期的不同时期v个体发育不同阶段个体发育不同阶段v不同的器官和组织不同的器官和组织v不同的外界环境下不同的外界环境下 各种基因的表达与否、量的差异、表达各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何部位如何第2页，共55页，编辑于2022年，星期六5.5.转录物组转录物组5.1 Northern5.1 Northern杂交杂交v杂交主要步骤：提取总RNA（不同组织、不同器官）变性电泳制备目的基因探针转移尼龙膜（放射性或化学标记法）杂交扫描或放射自显影依据杂交信号的强弱、有无判断基因的表达部位、表达量、表达时期

2、等第3页，共55页，编辑于2022年，星期六5.2SAGESAGE（serialsanalysisofgeneexpression）基因表达系列分析1995Velculescu及其同事年创立第4页，共55页，编辑于2022年，星期六SAGESAGE特点：特点：v进行转录物组研究，也就是转录水平的研究；v通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息；v SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物，最大限度地收集基因组的基因表达信息，这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策

3、略；vSAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速；第5页，共55页，编辑于2022年，星期六SAGE SAGE 技术的主要理论依据：技术的主要理论依据：v来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（911bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）；v通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达风度（ab

4、undance）。第6页，共55页，编辑于2022年，星期六1.将5g含有oligodT（引物）的磁珠与RNA混合。2.合成双链cDNA。3.用Nla酶消化形成一条链末端有标签的产物。4.将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备用BsmF1消化。5.用Mme I切割每一个样品形成约60bp的标签。SAGE 步骤步骤第7页，共55页，编辑于2022年，星期六6.延伸5秒，连接成约130bp的双链标签。7.PCR扩增。8.用Nla酶切130bp产物释放34bp双链标签。9.连接片断形成串联体。10.克隆到pZErO-1+里，并测序。第8页，共55页，编辑于2022年，星期六SAGE实例实例第

5、9页，共55页，编辑于2022年，星期六5.3 基因芯片v何为生物芯片?生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义 的科学技术革命。第10页，共55页，编辑于2022年，星期六n生物芯片分类第11页，共55页，编辑于2022年，星期六 基基因因芯芯片片技技术术是是指指通通过过微微阵阵列列(Microarray)(Microarray)技技术术将将高高密密度度DNADNA片片段段阵阵列列通通过过高高速速机机器器人人或或原原位位合合成成方方式式以以一

6、一定定的的顺顺序序或或排排列列方方式式使使其其附附着着在在如如玻玻璃璃片片等等固固相相表表面面，以以荧荧光光标标记记的的DNADNA探探针针，借借助助碱碱基基互互补补杂杂交交原原理理，进进行行大大量量的的基基因因表表达达及及监测等方面研究的最新革命性技术监测等方面研究的最新革命性技术。n基因芯片基因芯片第12页，共55页，编辑于2022年，星期六v基因芯片发展历史基因芯片发展历史Southern&Northern Southern&Northern BlotBlotDot Dot BlotBlotMacroarrayMacroarrayMicroarrayMicroarray第13页，共55页

7、，编辑于2022年，星期六v基因芯片的主要应用基因芯片的主要应用基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等突变检测 BRCA基因外显子、CFTR基因、-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分系析，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 第14页，共55页，编辑于2022年，星期六nTypesofDNAChips第15页，共55页，编辑于2022年，星期六v基因芯片研制的总体蓝图基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定

8、检测样品 的制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析第16页，共55页，编辑于2022年，星期六v表达芯片的制备检测流程表达芯片的制备检测流程第17页，共55页，编辑于2022年，星期六v表达芯片实例PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库扩增产物扩增产物点样于包被的玻片上DNA芯片热击T细胞cDNA未处理的细胞cDNA杂交杂交激光共聚焦扫描发现17个差异表达基因,11个被热诱导,6个被热抑制,发现其中3个为未发现的新基因第18页，共55页，编辑于2022年，星期六6.6.蛋白质组蛋白质组 DNAmRNAPROTEIN(活性活性)转录水平调控(transcriptionalcontrol

9、)翻译水平调控(Translationalcontrol)翻译后水平调控(Post-translationalcontrol)第19页，共55页，编辑于2022年，星期六6.1蛋白质组(Proteome)vProteome来源于 Proteins和 genome 两个词的组合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因组表达的蛋白质.第20页，共55页，编辑于2022年，星期六v蛋白质组定义蛋白质组定义 广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质;狭义上狭义上,可以指不同时期细胞内蛋白质的变化可以指不同时期细

10、胞内蛋白质的变化.v蛋白质组学定义蛋白质组学定义 研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学.v蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容:分析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量分析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量;确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能等性和特定功能等 第21页，共55页，编辑于2022年，星期六6.2 蛋白质组分析复杂性v蛋白质有许多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；vmRNA 的可变剪接、程序性移码和可控突变，1个基因可编码许多不同的蛋白

11、质，常常表现为组织特异性；v蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异源二聚体、三聚体或多聚体，不同的结合状态有不同的活性；v1种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与1种反应。第22页，共55页，编辑于2022年，星期六6.36.3蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术 蛋白质组主要研究技术：蛋白质组主要研究技术：双向电泳双向电泳 生物质谱技术生物质谱技术 蛋白质芯片蛋白质芯片 酵母双杂交酵母双杂交第23页，共55页，编辑于2022年，星期六6.3.1 6.3.1 双向凝胶电泳双向凝胶电泳 样品制备（包括蛋白质的溶解、变性及还原，从而去除非蛋白质杂质等）第一向等电聚焦（根据蛋白质电荷差异进行分离

12、）第二向SDS-PAGE（以蛋白质分子量差异为基础）蛋白质的检测（用考马斯亮蓝、银染、铜染等方法）图谱数字化分析（图象扫描、确定每个蛋白质点的等电点和分子量，寻找差异蛋白）第24页，共55页，编辑于2022年，星期六6.3.2 蛋白质组分析技术 主要蛋白质组分析技术：质谱方法 蛋白质序列分析 氨基酸组成分析第25页，共55页，编辑于2022年，星期六v质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量。v质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。第26页，共55页，编辑于2022年，星期六v质谱技术在蛋白组研究中的应用：

13、质谱技术在蛋白组研究中的应用：A 肽质谱和肽序列分析 蛋白质经双向电泳后，分离到的蛋白质被切割下来，进行胶内酶解，或转移到PVDF膜上，进行膜上膜解，然后上样进行测序。但目前质谱法还不能够取代Edman降解法测序，可是其测定速度较快。第27页，共55页，编辑于2022年，星期六B 鉴定翻译后修饰的蛋白质鉴定翻译后修饰的蛋白质 质谱可通过特征离子监测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点；质谱可与蛋白酶解和糖苷酶酶解结合，寻找糖肽，鉴定糖基化位点；质谱还参与糖链组成、结构甚至分支情况等的分析。第28页，共55页，编辑于2022年，星期六C 质谱技术的其他作用 质谱可对蛋白质二硫键进行

14、定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。第29页，共55页，编辑于2022年，星期六6.4蛋白质组数据库的建立和生物信息学 数据库的建立是蛋白质组研究的最重要的一个方面。蛋白质的数据库包括：蛋白质序列数据库 质谱数据库 双向电泳图谱数据库 有关蛋白质结构的数据库第30页，共55页，编辑于2022年，星期六6.5 与疾病相关蛋白质研究的基本策略第31页，共55页，编辑于2022年，星期六6.6 蛋白质组研究的目的v建立蛋白质互作网络v为人们了解生物体的各个生长、发育期的各个蛋白质有机组成、协作，更完整的解释各种生命现象奠定基础v促进人类疾病的

15、治疗第32页，共55页，编辑于2022年，星期六第33页，共55页，编辑于2022年，星期六本章要点v已知一个DNA片段，如何预测其开放读码框?vRACE技术的基本原理是什么?v动物园杂交的原理v基因剔除法vRNAi的作用原理及应用v酵母双列杂交的原理vSAGE 的基本原理及技术路线v什么是蛋白质组、蛋白质组学，以及蛋白质组的研究目的和意义？第34页，共55页，编辑于2022年，星期六第三章第三章 物理作图物理作图(physical mapping)物理作图物理作图:应用分子生物学技术直接将应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置定在基因组

16、的实际位置物理图的距离物理图的距离:依作图方法而异依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为辐射杂种作图的计算单位为厘镭厘镭(cR);限制限制性片段作图与克隆作图的图距单位为性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对碱基对(bp)第35页，共55页，编辑于2022年，星期六物理作图的方法物理作图的方法 n 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)(Restriction Mapping)n 依靠克隆的基因组作图依靠克隆的基因组作图(clone-based mapping)(clone-based mapping)n 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent i

17、n situ (Fish,Fluorescent in situ hybridization)hybridization)n 序标位作图序标位作图 (STS(STS，Sequence taged site)Sequence taged site)第36页，共55页，编辑于2022年，星期六1.1.限制性作图限制性作图 它是将限制性酶切位点标定在它是将限制性酶切位点标定在DNADNA分子的相对位置分子的相对位置.其只能应用于较小的其只能应用于较小的DNADNA分子分子,其上限取决于作图其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率分子中限制酶位点的频率.通常采用的通常采用的6 6碱基对识别顺序的限制酶仅

18、适合碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb50Kb以下以下DNADNA分子的精确作图分子的精确作图.第37页，共55页，编辑于2022年，星期六1.1 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理基本原理1Kb EcoR I待检的待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH 第38页，共55页，编辑于2022年，星期六跨叠克隆群跨叠克隆群(Contig)酶切位点酶切位点第39页，共55页，编辑于2022年，星期六1.2 限制酶作图的改进n n脉冲凝胶电泳脉冲凝胶电泳(pulsed-f

19、ield gel electrophoresis)(pulsed-field gel electrophoresis)n n稀有切点限制图绘制第40页，共55页，编辑于2022年，星期六稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项稀有切点限制图绘制注意事项:识别顺序越长产生的片段越大识别顺序越长产生的片段越大;识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组如人类基因组A/TA/T比例接近比例接近60/%,60/%,选用高比例选用高比例A/TA/T位点限制酶位点限制酶,产生的产生的片段多于高比例片段多于高比例G/CG/

20、C识别位点酶识别位点酶 有些限制酶识别位点较长有些限制酶识别位点较长 如酵母的如酵母的-SceSce识别顺序为识别顺序为18bp,18bp,如果高等真核生物基因组中无此序列如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中体转导的方法将其引入代测基因组中.基因组基因组DNA DNA 的甲基化状态的甲基化状态 如人类活细胞基因组中大量如人类活细胞基因组中大量5 5-CG-3-CG-3 顺序的胞嘧啶被甲基化顺序的胞嘧啶被甲基化,使许使许多含有多含有5 5-CG-3-CG-3 顺序的内切酶很少找到可切位点顺序的内切酶很少找到可切位点.第41

21、页，共55页，编辑于2022年，星期六2.1 大片段大片段DNA的克隆载体的克隆载体n YAC:YAC:酵母人工染色体酵母人工染色体 230-1700Kb230-1700Kbn BAC:BAC:细菌人工染色体细菌人工染色体 300Kb300Kbn PAC:P1 PAC:P1人工染色体人工染色体 300Kb 300Kb n Fosmids:30Kb Fosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图第42页，共55页，编辑于2022年，星期六2.2 重叠群组建n n重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.n n重叠群的组建方法 染色体步移法第43页，共55页，编辑于2022年，星期六 指纹作图法

22、指纹作图法指纹作图法指纹作图法 指纹指纹:系指确定系指确定DNADNA样品所具有的样品所具有的DNADNA片段片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.常用的指纹分析方法常用的指纹分析方法:A A 限制性带型限制性带型(restriction patterns)(restriction patterns)指纹指纹 B B 重复顺序重复顺序DNADNA指纹指纹(repetitive DNA fingerprints)(repetitive DNA fingerprints)C STS C STS目录作图目录作图(STS content

23、 mapping)(STS content mapping)D D 重复重复DNA PCR(repetitive DNA PCR)DNA PCR(repetitive DNA PCR)或分散重或分散重 复顺序复顺序PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)PCR(interspersed repeat element PCR,IRE-PCR)指纹指纹第44页，共55页，编辑于2022年，星期六第45页，共55页，编辑于2022年，星期六3.荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)将探针

24、用荧光标记，与细胞分裂中期的将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。处的位置，将探针标定在连锁图上。第46页，共55页，编辑于2022年，星期六用用DNA纤维分析水稻第纤维分析水稻第4号染色体号染色体第47页，共55页，编辑于2022年，星期六 4.序标位作图序标位作图(STS,Sequence Taged Site)长度长度:100-500 bp序列已知序列已知,可以设计可以设计PCR反应反应单拷贝单拷贝,在染色体上的位置是唯一的在染色体上的位置是唯一的EST(Expressed sequence

25、tag)大部分可以作大部分可以作STS第48页，共55页，编辑于2022年，星期六4.1 STS作图原理第49页，共55页，编辑于2022年，星期六4.2 寻找STS的方法:n n表达顺序标签(expressed sequence tag，EST)从从cDNAcDNA中找到的小段顺序中找到的小段顺序,但基因家族成但基因家族成员间共有的序列不能用于员间共有的序列不能用于STSSTS。n nSSLP（simple sequence length polymorphisrns，SSLPs）n n随机基因组顺序第50页，共55页，编辑于2022年，星期六ESTn1990年，Brenneer等首先提出人

26、类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为。nEST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的端和端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。n由于大多数的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式。第51页，共55页，编辑于2022年，星期六

27、4.3 STS的物理图定位n n辐射杂种不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤辐射杂种群PCR检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度第52页，共55页，编辑于2022年，星期六n n克隆作图构建全基因组DNA基因文库构建指定单一染色体的基因文库PCR检测STS分子标记根据重叠STS标记绘制克隆连锁图提取基因组DNA流式细胞仪分离染色体打断打断第53页，共55页，编辑于2022年，星期六用用STS构建构建Contig第54页，共55页，编辑于2022年，星期六本章主要内容：n n物理作图法n n常用物理作图法有那几种n n常用的指纹分析方法有哪些，它们的分析机理是什么n n序标位作图如何作图序标位作图如何作图第55页，共55页，编辑于2022年，星期六