《基因工程》PPT课件.ppt

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1、第七章第七章 基因工程基因工程 (gene engineering)1 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激

2、活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体诊断试验、肿瘤导向治疗诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱2第一节第一节 重组重组DNA技术的原理技术的原理l l重组重组重组重组DNADNA技术是指将一种生物体技术是指将一种生物体技术是指将一种生物体技术是指将一种生物体（供体）（供体）（供体）（供体）的基因的基因的基因的基因与与与与载体载体载体载体在在在在体外体外体外体外进行拼接重组，然后转入另一种生物进行拼接重组，然后转入另一种生物进行拼接重组，然

3、后转入另一种生物进行拼接重组，然后转入另一种生物体体体体（受体）（受体）（受体）（受体）内，使之内，使之内，使之内，使之按照人们的意愿按照人们的意愿按照人们的意愿按照人们的意愿稳定遗传并表稳定遗传并表稳定遗传并表稳定遗传并表达出新产物或新性状的达出新产物或新性状的达出新产物或新性状的达出新产物或新性状的DNADNA体外操作过程。体外操作过程。体外操作过程。体外操作过程。l l也称为也称为也称为也称为分子克隆技术分子克隆技术分子克隆技术分子克隆技术,基因克隆或基因工程基因克隆或基因工程基因克隆或基因工程基因克隆或基因工程l l供体供体供体供体、受体受体受体受体、载体载体载体载体是重组是重组是重组

4、是重组DNADNA技术的三大基本元技术的三大基本元技术的三大基本元技术的三大基本元素。素。素。素。3 基因工程的操作过程基因工程的操作过程酶切酶切酶切酶切连接连接连接连接转化转化转化转化扩增扩增扩增扩增检测检测目的基因的获取目的基因的获取 克隆载体的构建克隆载体的构建外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接（体外重组）体外重组）重组重组DNA导入受体菌导入受体菌转化子的筛选和鉴定转化子的筛选和鉴定克隆基因的表达克隆基因的表达4目的目的基因的克隆：基因的克隆：l l基因工程或基因工程或基因工程或基因工程或DNADNA重组技术的前提条件是从生物体中分重组技术的前提条件是从生物体中分重组技术的前提条

5、件是从生物体中分重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。离克隆目的基因。离克隆目的基因。离克隆目的基因。l l一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生，即将某生，即将某生，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型

6、物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用另一类是利用另一类是利用另一类是利用PCRPCR扩增技术甚至化学合成法体外直接扩增技术甚至化学合成法体外直接扩增技术甚至化学合成法体外直接扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因合成目的基因合成目的基因合成目的基因，然后将之克隆表达。，然后将之克隆表达。，然后将之克隆表达。，然后将之克隆表达。5第二节第二节 核酸的提取及检测核酸的提取及检测l l 就基因工程而言，核酸就

7、基因工程而言，核酸就基因工程而言，核酸就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主分子是其研究所涉及的主分子是其研究所涉及的主分子是其研究所涉及的主要对象，所以要对象，所以要对象，所以要对象，所以核酸的分离核酸的分离核酸的分离核酸的分离与提取与提取与提取与提取是研究中很重要的是研究中很重要的是研究中很重要的是研究中很重要的基本技术。基本技术。基本技术。基本技术。l l 核酸样品的质量将直接核酸样品的质量将直接核酸样品的质量将直接核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。关系到实验的成败。关系到实验的成败。关系到实验的成败。61.基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化l lDNA主要存在于细胞核的

8、染色体中。主要存在于细胞核的染色体中。l l核外也有少量核外也有少量DNA，如线粒体，如线粒体DNA（mtDNA），），叶绿体叶绿体DNA（cpDNA），），质粒质粒DNA。l l总的原则总的原则:保证一级结构的完整性保证一级结构的完整性;排除其它分子的污染排除其它分子的污染;7一般步骤一般步骤:(1)破碎细胞，裂解细胞壁破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法机械方法:超声波处理、研磨、超声波处理、研磨、匀浆匀浆 化学方法化学方法:SDS（阴离子去垢剂）（阴离子去垢剂）EDTA，使得，使得DNase失活失活(why?)酶学方法酶学方法:溶菌酶或蜗牛酶溶菌酶或蜗牛酶(2)通过蛋白质变性通过蛋白质变性或分

9、解，使或分解，使 DNA游离出来游离出来(3)分离分离DNA82.cDNA的分离与纯化的分离与纯化（1 1）总）总）总）总RNA RNA 的提取的提取的提取的提取l lRNaseRNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 l lRNaseRNase的来源的来源的来源的来源 外源：操作者，实验器皿，试剂，空气外源：操作者，实验器皿，试剂，空气外源：操作者，实验器皿，试剂，空气外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同内源：不同组织和细胞数量不同内源：不同组织和细胞数量不同内源：不

10、同组织和细胞数量不同l l创造无创造无创造无创造无RNaseRNase的环境的环境的环境的环境 DEPC(DEPC(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)（配成（配成（配成（配成0.1%0.1%的的的的DEPC DEPC 水）水）水）水）异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍l lTrizolTrizol试剂试剂试剂试剂9逆转录过程中逆转录过程中cDNA的合成的合成依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶核糖核酸酶核糖核酸酶H活力活力依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶10 Trizol试剂试剂 Trizol Trizol的主要成分是的主要成分是的主要成分是的主要成分是苯酚苯酚苯酚苯

11、酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制性蛋白质，但不能完全抑制性蛋白质，但不能完全抑制性蛋白质，但不能完全抑制RNARNA酶活性，因此酶活性，因此酶活性，因此酶活性，因此TrizolTrizol中还加入了中还加入了中还加入了中还加入了8-8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、羟基喹啉、异硫氰酸胍、羟基

12、喹啉、异硫氰酸胍、羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯巯巯巯基乙醇等来抑制内源和外源基乙醇等来抑制内源和外源基乙醇等来抑制内源和外源基乙醇等来抑制内源和外源RNaseRNase（RNARNA酶）。酶）。酶）。酶）。110.1%0.1%的的的的8-8-羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉羟基喹啉可以可以可以可以抑制抑制抑制抑制RNaseRNase，与氯，与氯，与氯，与氯仿联合使用可增强抑制作用。仿联合使用可增强抑制作用。仿联合使用可增强抑制作用。仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的属于解偶剂，是一类强力的属于解偶剂，是一类强力的属于解偶剂，是一类强力的蛋蛋蛋蛋白质

13、变性剂白质变性剂白质变性剂白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。离。离。离。-巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇的主要作用是的主要作用是的主要作用是的主要作用是破坏破坏破坏破坏RNaseRNase蛋蛋蛋蛋白质中的二硫键白质中的二硫键白质中的二硫键白质中的二硫键。12Trizol法提取总法提取总RNA的实验原理：的实验原理：Tri

14、zol Trizol试剂裂解细胞并释放出试剂裂解细胞并释放出试剂裂解细胞并释放出试剂裂解细胞并释放出RNA,RNA,酸性条件使酸性条件使酸性条件使酸性条件使RNARNA与与与与DNADNA分离分离分离分离,加入氯仿后离心，样品分成加入氯仿后离心，样品分成加入氯仿后离心，样品分成加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机水样层和有机水样层和有机水样层和有机层层层层。RNA RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，存在于水样层中。收集上面的的水样层后，存在于水样层中。收集上面的的水样层后，存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNARNA可以通过可以通过可以通过可以通过异丙醇沉淀异丙醇沉淀异丙醇沉淀

15、异丙醇沉淀来还原。来还原。来还原。来还原。在除去水样层后，样品中的在除去水样层后，样品中的在除去水样层后，样品中的在除去水样层后，样品中的DNADNA和蛋白也能相继以和蛋白也能相继以和蛋白也能相继以和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。沉淀的方式还原。沉淀的方式还原。沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的乙醇沉淀能析出中间层的乙醇沉淀能析出中间层的乙醇沉淀能析出中间层的DNADNA，在在在在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。13（2）第一链的合成）第一链的合成14 （3）第二链的合成）第二链的合成 cDNA第二链

16、的合成方法第二链的合成方法自身引导法自身引导法 15自身引导合成法较难控制反应，而且用自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶核酸酶切割切割发夹结构时无一例外地将导致对应于发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5端序列端序列出现缺失和重排，因而该方法目前出现缺失和重排，因而该方法目前很少使用很少使用。16 cDNA第二链的合成方法第二链的合成方法置换合成法置换合成法l l利用第一链在反转录酶作用下产生的利用第一链在反转录酶作用下产生的利用第一链在反转录酶作用下产生的利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNAcDNA:mRNA杂交链，不用碱变性（水解杂交链，不用碱变性（水解杂交链

17、，不用碱变性（水解杂交链，不用碱变性（水解mRNAmRNA），而是在），而是在），而是在），而是在dNTPsdNTPs存在下，存在下，存在下，存在下，利用利用利用利用RNARNA酶酶酶酶HH在杂交链的在杂交链的在杂交链的在杂交链的mRNAmRNA链上造成切口和缺口。链上造成切口和缺口。链上造成切口和缺口。链上造成切口和缺口。l l从而产生一系列从而产生一系列从而产生一系列从而产生一系列RNARNA引物，使之成为合成第二链引物，使之成为合成第二链引物，使之成为合成第二链引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌的引物，在大肠杆菌的引物，在大肠杆菌的引物，在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚

18、合酶的作用下合成的作用下合成的作用下合成的作用下合成第二链。第二链。第二链。第二链。17cDNA第二链的合成方法第二链的合成方法置换合成法置换合成法DNApol dNTPsDNApol dNTPsRNaesHRNaesH55pppppp55G G AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 55AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAApp 5555S1S1 AAAA AAAATTTTTTOHOH 33TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTpp 5555TTTTTTTTTTT

19、TTTTTTTTTTTTTTTTTOHOH 33AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 5555TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3333T4-DNA ligaseT4-DNA ligase该方法使用较多该方法使用较多183.质粒质粒DNA的分离与纯化的分离与纯化l l质粒（质粒（plasmid）:指细菌细胞质中独立于指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位细菌染色体之外能自主复制的遗传单位l l共价闭合环状共价闭合环状l l质粒质粒DNA的分离：细菌培养和质粒的分离：细菌培养和质粒DNA扩扩增；细菌菌体的裂解；质粒增；细菌菌体的裂解；质

20、粒DNA的分离的分离19质粒质粒DNA的提取的提取碱裂解法的原理碱裂解法的原理染色体染色体染色体染色体DNADNA比质粒比质粒比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为线状分子，而质粒为线状分子，而质粒为线状分子，而质粒为线状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当用当用当用当用碱处理碱处理碱处理碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生容易发生容易发生容易发生变性，变性，变性，变性，共

21、价闭环的质粒共价闭环的质粒共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性在回到中性在回到中性pHpH时即恢复时即恢复时即恢复时即恢复其天然构象；其天然构象；其天然构象；其天然构象；变性染色体变性染色体变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合片段与变性蛋白质和细胞碎片结合片段与变性蛋白质和细胞碎片结合片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的形成沉淀，而复性的形成沉淀，而复性的形成沉淀，而复性的超螺旋质粒超螺旋质粒超螺旋质粒超螺旋质粒DNADNA分子分子分子分子则以溶解则以溶解则以溶解则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。状态存在液相中，从而

22、可通过离心将两者分开。状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。204.核酸的检测核酸的检测l l包括包括包括包括DNADNA的质量、大小、纯度检测的质量、大小、纯度检测的质量、大小、纯度检测的质量、大小、纯度检测l l紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法 dsDNA dsDNA：1A1A260260 50ug/ml;50ug/ml;ssDNAssDNA:1A:1A260 260 37ug/ml;37ug/ml;RNA RNA：1A1A260 260 40ug/ml;40ug/ml;寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸：1A1A

23、260 260 30ug/ml;30ug/ml;A A260260/A/A280 280 1.651.651.851.85（DNADNA）；）；）；）；1.7 1.7 2.0(2.0(RNARNA)比值低，有蛋白质、酚类等污染（比值低，有蛋白质、酚类等污染（比值低，有蛋白质、酚类等污染（比值低，有蛋白质、酚类等污染（why?why?）l l凝胶电泳法凝胶电泳法凝胶电泳法凝胶电泳法21 凝胶电泳技术凝胶电泳技术l l样品的物理性质样品的物理性质 分子大小、电荷、空间构型分子大小、电荷、空间构型l l支持物介质支持物介质 琼脂糖，琼脂糖，100-60000bp,聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺，1-500b

24、pl l电场强度电场强度，5V/cml l缓冲液离子强度缓冲液离子强度 TAE,TBE,TPE 22 电泳缓冲液是指在进行分子电泳缓冲液是指在进行分子电泳缓冲液是指在进行分子电泳缓冲液是指在进行分子电泳时所使用的电泳时所使用的电泳时所使用的电泳时所使用的缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液，用以，用以，用以，用以稳定体系酸碱度稳定体系酸碱度稳定体系酸碱度稳定体系酸碱度。缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的的的的pHpH。电泳时正极与负极都会发生。电泳时正极与负极都会发生。电泳时正极

25、与负极都会发生。电泳时正极与负极都会发生电解反应电解反应电解反应电解反应，长，长，长，长时间的电泳将使时间的电泳将使时间的电泳将使时间的电泳将使正极变酸，负极变碱正极变酸，负极变碱正极变酸，负极变碱正极变酸，负极变碱。一个好的。一个好的。一个好的。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pHpH保持基本不变。保持基本不变。保持基本不变。保持基本不变。23 电泳缓冲液的另一个作用是电泳缓冲液的另一个作用是电泳缓冲液的另一个作用是电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定使溶

26、液具有一定使溶液具有一定使溶液具有一定的导电性的导电性的导电性的导电性，以利于，以利于，以利于，以利于DNADNA分子的迁移，例如，一分子的迁移，例如，一分子的迁移，例如，一分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有的般电泳缓冲液中应含有的般电泳缓冲液中应含有的般电泳缓冲液中应含有的NaNa+离子，离子，离子，离子，NaNa+离子的离子的离子的离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。的电流使胶发热甚至熔化。的电流使胶发热甚至熔化。的电流使胶

27、发热甚至熔化。电泳缓冲液还有一个组分是电泳缓冲液还有一个组分是电泳缓冲液还有一个组分是电泳缓冲液还有一个组分是EDTAEDTA，加入浓加入浓加入浓加入浓度为度为度为度为1-2mmol/L1-2mmol/L，目的是螯合，目的是螯合，目的是螯合，目的是螯合MgMg2+2+等离子，防止等离子，防止等离子，防止等离子，防止电泳时激活电泳时激活电泳时激活电泳时激活 DNA DNA酶，此外还可防止酶，此外还可防止酶，此外还可防止酶，此外还可防止MgMg2+2+离子与离子与离子与离子与核酸生成沉淀。核酸生成沉淀。核酸生成沉淀。核酸生成沉淀。24琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨分辨DNA片段的

28、能力片段的能力凝胶凝胶类型及浓度（类型及浓度（%）分离分离DNA片段的大小片段的大小(bp)Agarose 0.3 500001000 0.7 200001000 1.4 6000300PAG 4.0 1000100 10.0 50025 20.0 50125l l指示剂指示剂 溴酚蓝，二甲苯青溴酚蓝，二甲苯青 终止酶反应终止酶反应;便于加样便于加样;监视实验进行监视实验进行;l l染色剂染色剂 溴化乙锭溴化乙锭(EB)吖叮橙吖叮橙EB可检测到可检测到ng级的级的DNA，荧光强度与荧光强度与DNA数量成数量成正比正比26操作过程操作过程2728DNA分子大小的检测分子大小的检测NEB，1Kb

29、DNA Ladder：3kb=62.5ng，1kb=21.0ngPCR产物产物3Kb1Kb29第三节第三节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交l l杂交的基本原理：具有一定同源性的两条核酸杂交的基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补原则退火形成双链，可按碱基互补原则退火形成双链.E.Southern，197530l l类似于类似于类似于类似于DNADNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNADNA 模板模板模板模板加热加热加热加热变性变性变性变性解链，

30、随之将反应混合物冷却至某一温解链，随之将反应混合物冷却至某一温解链，随之将反应混合物冷却至某一温解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生度，这一温度可使引物与它的靶序列发生度，这一温度可使引物与它的靶序列发生度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火退火退火退火，再将温度升高使退火引物在再将温度升高使退火引物在再将温度升高使退火引物在再将温度升高使退火引物在DNADNA聚合酶作用下得聚合酶作用下得聚合酶作用下得聚合酶作用下得以以以以延伸延伸延伸延伸。l l这种这种这种这种热变性热变性热变性热变性-复性复性复性复性-延伸延伸延伸延伸的过程的过程的过程的过程 就是一个就

31、是一个就是一个就是一个PCRPCR循环，循环，循环，循环，PCRPCR就就就就 是这种循环的不断重复。是这种循环的不断重复。是这种循环的不断重复。是这种循环的不断重复。第四节第四节 PCR技术技术（The polymerase chain reaction）31PCR原理：原理：请注意引物结合的位置请注意引物结合的位置32第五节第五节 基因文库的构建基因文库的构建1.1.基因文库的概念基因文库的概念基因文库的概念基因文库的概念l l基因文库基因文库基因文库基因文库DNA library,DNA bankDNA library,DNA bank：用用用用重组重组重组重组DNADNA技术技术技术技

32、术将某种生物细胞的总将某种生物细胞的总将某种生物细胞的总将某种生物细胞的总 DNA DNA 或染或染或染或染色体色体色体色体DNADNA的所有片段随机地连接到基因载体上，然后的所有片段随机地连接到基因载体上，然后的所有片段随机地连接到基因载体上，然后的所有片段随机地连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的片段的片段的片段的克隆克隆克隆克隆，在制备的克隆数目多到可以把某种生物，在制备的克隆数目多到可以把某种生物，在制备的克隆数

33、目多到可以把某种生物，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。就被称为某种生物的基因文库。就被称为某种生物的基因文库。就被称为某种生物的基因文库。3334 基因组基因组DNA文库，文库，Genomic libraries:含有某含有某种生物体全部基因的随机片段的重组种生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆克隆群体；群体；l lcDNA文库，文库，cDNA libraries：是指含有所有重

34、是指含有所有重组组cDNA的克隆群体。的克隆群体。基因文库的种类基因文库的种类:352.目的基因的获取目的基因的获取l l来源于生物材料：来源于生物材料：cDNAl lPCR反应：反应：目的基因的（部分）序列已知目的基因的（部分）序列已知l l化学合成法：化学合成法：要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列 363.用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体l l定义定义定义定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋

35、白质所采用的一些意义的蛋白质所采用的一些意义的蛋白质所采用的一些意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子。分子。分子。分子。l l功能功能功能功能：运送外源基因：运送外源基因：运送外源基因：运送外源基因高效转入受体高效转入受体高效转入受体高效转入受体细胞；为外源基细胞；为外源基细胞；为外源基细胞；为外源基因因因因提供复制能力或整合能力提供复制能力或整合能力提供复制能力或整合能力提供复制能力或整合能力；为外源基因的；为外源基因的；为外源基因的；为外源基因的扩增或扩增或扩增或扩增或表达提供必要的条件表达提供必要的条件表达提供必要的条件表达提供必要的条件l l常用载体常用载体常用载体常用载体：克隆载

36、体，表达载体克隆载体，表达载体克隆载体，表达载体克隆载体，表达载体 如：质粒载体，噬菌体载体，如：质粒载体，噬菌体载体，如：质粒载体，噬菌体载体，如：质粒载体，噬菌体载体，YAC YAC，动植物病毒，动植物病毒，动植物病毒，动植物病毒等。等。等。等。37载体的基本特点载体的基本特点:l l能能自主复制自主复制；l l具有一个以上的具有一个以上的遗传标记遗传标记，便于重组体的筛，便于重组体的筛选和鉴定；选和鉴定；l l有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多插入点），常具有多个单一酶切位点，称为个单一酶切位点，称为多克隆位点多克隆位点；l l分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以

37、容纳较大的外源DNA。38质质粒粒载载体体 oriori 复制起点复制起点复制起点复制起点 MCS MCS 多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点 AmpAmpr r 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因 LacZLacZ -半乳糖苷酶基因的部分序列半乳糖苷酶基因的部分序列半乳糖苷酶基因的部分序列半乳糖苷酶基因的部分序列 P P 启动子启动子启动子启动子AmpAmprrlacZlacZMCSMCSP PT7T7orioriP PSP6SP6pGEM3z39PGEM-TPGEM-T载体图谱载体图谱载体图谱载体图谱404.DNA的的体外重组体外重组41EcoR

38、5 35 33 53 5 回文序列回文序列 palindromic seq限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶42Sma ICCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC 粘性末端粘性末端 cohensive end 平末端平末端 blunt end43常见的限制性内切酶酶切位点常见的限制性内切酶酶切位点常见的限制性内切酶酶切位点常见的限制性内切酶酶切位点44DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）l lDNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNA一端一端3-OH与另一双与另一双链链DNA的的5端磷酸根端磷酸根形成形成35磷酸二酯键，磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的使具有相同粘性末端或平端

39、的DNA两端连接起两端连接起来。来。45 限制性内切酶识别的靶序列与限制性内切酶识别的靶序列与DNA的来的来源无关源无关，任何不同来源的，任何不同来源的DNA，经过适当，经过适当限制酶处理后，都能通过它们的粘性或平限制酶处理后，都能通过它们的粘性或平齐末端连接起来，这是齐末端连接起来，这是DNA重组技术的基重组技术的基础。础。465.重组重组DNA分子的转化分子的转化 转化转化转化转化是指将质粒或其他是指将质粒或其他是指将质粒或其他是指将质粒或其他外源外源外源外源DNADNA导入处于导入处于导入处于导入处于感受感受感受感受态的态的态的态的宿主细胞，并使其宿主细胞，并使其宿主细胞，并使其宿主细胞

40、，并使其获得新的表型的过程。获得新的表型的过程。获得新的表型的过程。获得新的表型的过程。转化常用的宿主细转化常用的宿主细转化常用的宿主细转化常用的宿主细胞是胞是胞是胞是大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌。增殖转化细胞，使增殖转化细胞，使增殖转化细胞，使增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细得有足够数量的转化细得有足够数量的转化细得有足够数量的转化细胞用于筛选程序胞用于筛选程序胞用于筛选程序胞用于筛选程序。476.阳性克隆的筛选和检测阳性克隆的筛选和检测目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连重组体重组体48阳

41、性克隆的检测方法阳性克隆的检测方法:l l抗药性标记选择抗药性标记选择l l蓝白斑筛选蓝白斑筛选l l分子杂交法分子杂交法l l插入片段大小的鉴定（酶切，插入片段大小的鉴定（酶切，PCR）l l测序测序49 许多载体（如许多载体（如许多载体（如许多载体（如M13M13系列、系列、系列、系列、pUCpUC系列、系列、系列、系列、pGEMpGEM系列）系列）系列）系列）载体上带有大肠杆菌的载体上带有大肠杆菌的载体上带有大肠杆菌的载体上带有大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（lacZlacZ）的）的）的）的调调调调控序列和前控序列和前控序列和前控序列和前146146

42、个氨基酸（个氨基酸（个氨基酸（个氨基酸（LacZLacZ ）的编码信息。在这的编码信息。在这的编码信息。在这的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（个编码区中插入了一个多克隆位点（个编码区中插入了一个多克隆位点（个编码区中插入了一个多克隆位点（MCSMCS），它并不），它并不），它并不），它并不破坏读码框（破坏读码框（破坏读码框（破坏读码框（ORFORF），可使少数几个氨基酸插入到），可使少数几个氨基酸插入到），可使少数几个氨基酸插入到），可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能。半乳糖苷酶的氨基端而不影响

43、功能。蓝白斑筛选的原理：蓝白斑筛选的原理：（-互补）互补）50乳糖操纵子乳糖操纵子l LacZ基因编码半乳糖苷酶基因编码半乳糖苷酶l分解分解XgalBlue productlLacZ复习复习51 这种载体适用于可编码这种载体适用于可编码这种载体适用于可编码这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端部分序端部分序端部分序端部分序列列列列的宿主细胞的宿主细胞的宿主细胞的宿主细胞(如如如如E.coliE.coli DH5 DH5 )。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，因此，宿主和质

44、粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，这样，这样，这样，lacZlacZ基因在缺少基因在缺少基因在缺少基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞近操纵基因区段的宿主细胞近操纵基因区段的宿主细胞近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为称为称为称为-互补互补互

45、补互补。52 由由由由-互补而产生的互补而产生的互补而产生的互补而产生的LacZLacZ+细菌在诱导剂细菌在诱导剂细菌在诱导剂细菌在诱导剂IPTGIPTG的作用下，在生色底物的作用下，在生色底物的作用下，在生色底物的作用下，在生色底物X-GalX-Gal存在时产生存在时产生存在时产生存在时产生蓝色菌蓝色菌蓝色菌蓝色菌落落落落，因而易于识别。，因而易于识别。，因而易于识别。，因而易于识别。然而，当外源然而，当外源然而，当外源然而，当外源DNADNA插入到质粒的多克隆位点插入到质粒的多克隆位点插入到质粒的多克隆位点插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无后，几乎不可避免地导致无后，几乎不可避

46、免地导致无后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端互补能力的氨基端互补能力的氨基端互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成片段，使得带有重组质粒的细菌形成片段，使得带有重组质粒的细菌形成片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落。这种重组子的筛选，又称为这种重组子的筛选，又称为这种重组子的筛选，又称为这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选蓝白斑筛选。5354 互互补补的的检检测测55567.基因文库的应用基因文库的应用l l建立和使用基因文库是建立和使用基因文库是建立和使用基因文库是建立和使用基因文库是分离基因分离基因分离基因分离基因，特别是分离

47、高等，特别是分离高等，特别是分离高等，特别是分离高等真核生物基因的有效手段。真核生物基因的有效手段。真核生物基因的有效手段。真核生物基因的有效手段。l l如果一个哺乳动物的基因组是如果一个哺乳动物的基因组是如果一个哺乳动物的基因组是如果一个哺乳动物的基因组是 310 3109 9碱基对，直接碱基对，直接碱基对，直接碱基对，直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的从细胞中提取并分离出某一特定基因的从细胞中提取并分离出某一特定基因的从细胞中提取并分离出某一特定基因的 DNA DNA片段片段片段片段在技术上是很困难的。在技术上是很困难的。在技术上是很困难的。在技术上是很困难的。但是在基因文库中，不同的

48、但是在基因文库中，不同的但是在基因文库中，不同的但是在基因文库中，不同的 DNA DNA片段都分别片段都分别片段都分别片段都分别在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，在不同的克隆中扩增了，只要有该基因的探针存在，则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简单的工作。单的工作。单的工作。单的工作。57 基因工程的主要目的之一，就是要制备大量基因工程的主要目的之一，就是

49、要制备大量基因工程的主要目的之一，就是要制备大量基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或得到了克隆的基因或得到了克隆的基因或得到了克隆的基因或cDNAcDNA后，按照正确的方后，按照正确的方后，按照正确的方后，按照正确的方向插入向插入向插入向插入表达载体表达载体表达载体表达载体，连在启动子的后面，导入相应，连在启动子的后面，导入相应，连在启动子的后面，导入相应，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。中，其表达方式不尽相同。中，其表达方式不尽相同。中，其表达方式不尽相同。第六节第六节 克隆基因的表达克隆基因的表达58表达载体表达载体59