层析分离法PPT讲稿.ppt
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1、层析分离法层析分离法第1页,共136页,编辑于2022年,星期日层析分离法层析分离法22 22 层析分离法(第一讲)层析分离法(第一讲)第一讲概述概述 特点:特点:(1 1)纯化倍数高纯化倍数高(2 2)操作规模小,放大困难操作规模小,放大困难(3 3)终产品纯化终产品纯化(4 4)适用于价格昂贵的产品适用于价格昂贵的产品第2页,共136页,编辑于2022年,星期日层析分离分类(层析分离分类(1 1)层析分离法层析分离法第一讲按溶质分子与固定相相互作用机理按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析(范德华力,氢键,静电力,共价力)吸附层析(范德华力,氢键,静电力,共价力)分配层析(溶质在两液相间分
2、配系数不同)分配层析(溶质在两液相间分配系数不同)凝胶过滤(分子大小与形状)凝胶过滤(分子大小与形状)实验技术分类实验技术分类低压(小于低压(小于0.5 Mpa)0.5 Mpa)中压中压 (0.5-5 Mpa)(0.5-5 Mpa)高压高压 (5-40 Mpa)(5-40 Mpa)电泳电泳 (溶质在电场中移动)溶质在电场中移动)第3页,共136页,编辑于2022年,星期日层析分离分类(层析分离分类(2 2)层析分离法层析分离法第一讲根据固定相形状分类根据固定相形状分类柱层析柱层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析根据流动相分类根据流动相分类气相层析气相层析液相层析液相层析超临界流体层析超临界流体层析
3、按操作方式分类按操作方式分类迎头法(迎头法(frontal analysis)frontal analysis)顶替法顶替法 (displacement analysis)displacement analysis)洗脱分析(洗脱分析(elution analysis)elution analysis)第4页,共136页,编辑于2022年,星期日基本概念基本概念层析分离法层析分离法第一讲(1 1)分配系数)分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值溶质在固定相与流动相浓度比值(2 2)解离常数)解离常数 吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸 附复合物浓度比值附复合物浓度比值
4、(3 3)分离因素)分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数 (4)(4)阻滞因子阻滞因子分配层析溶质移动速度与理想流动分配层析溶质移动速度与理想流动 相移动速度(距离)比值相移动速度(距离)比值 (5)(5)溶出体积溶出体积 在柱色层分离中,使溶质从柱中流在柱色层分离中,使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积出时所通过的流动相体积 (6)(6)分辨率分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均什之比两峰之间的距离与两峰宽的平均什之比 (7)(7)理论塔板理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡流动相与固定相平均浓度达传质平衡 时的一段柱高时的一段柱高(8 8)溶量因子
5、)溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总之比固定相中溶质总量与流动相中溶质总之比第5页,共136页,编辑于2022年,星期日第一讲层析分离法层析分离法第6页,共136页,编辑于2022年,星期日分配系数分配系数层析分离法层析分离法第一讲 K Kd d=C=C1 1/C/C1 1K K d d为分配系数为分配系数C C1 1,C C2 2为两液相中的溶质浓度。为两液相中的溶质浓度。应用条件:温度一定应用条件:温度一定 低浓度低浓度第7页,共136页,编辑于2022年,星期日分离度分离度层析分离法层析分离法第一讲第8页,共136页,编辑于2022年,星期日第一讲层析分离法层析分离法第9页,共13
6、6页,编辑于2022年,星期日 Rf=第一讲层析分离法层析分离法第10页,共136页,编辑于2022年,星期日洗脱容积洗脱容积层析分离法层析分离法第一讲第11页,共136页,编辑于2022年,星期日第一讲层析分离法层析分离法第12页,共136页,编辑于2022年,星期日理论塔板理论塔板第一讲r n E/(E+1)时 r max n E/(E+1)最大浓度塔板r max n E/(E+1)层析分离法层析分离法第13页,共136页,编辑于2022年,星期日第一讲层析分离法层析分离法第14页,共136页,编辑于2022年,星期日思考题思考题层析分离法层析分离法第一讲1 1 想解概念:解离常数,分离因
7、素,阻滞因子,想解概念:解离常数,分离因素,阻滞因子,理论塔板高度,洗胶体积,分辨率理论塔板高度,洗胶体积,分辨率2 2 不同的层析分类方法各有何意义?不同的层析分类方法各有何意义?第15页,共136页,编辑于2022年,星期日层析分离法(第二讲)层析分离法(第二讲)第二讲层析分离法层析分离法第16页,共136页,编辑于2022年,星期日层析介质层析介质层析分离法层析分离法第二讲要求:要求:(1 1)不溶于流动相)不溶于流动相(2 2)化学稳定)化学稳定(3 3)机械强度)机械强度(4 4)大的表面积)大的表面积(5 5)粒度均匀)粒度均匀层析介质种类层析介质种类无机(氧化铝,硅胶,活性碳)无
8、机(氧化铝,硅胶,活性碳)有机(琼脂糖,纤维素,聚丙烯酰胺)有机(琼脂糖,纤维素,聚丙烯酰胺)第17页,共136页,编辑于2022年,星期日常用层析介质常用层析介质层析分离法层析分离法第二讲氧化铝:氧化铝:(活性氧化铝)它是一种多孔性、高分散度固体(活性氧化铝)它是一种多孔性、高分散度固体(1 1)有很大的比表面积,其微孔表面具有吸附性能。)有很大的比表面积,其微孔表面具有吸附性能。(2 2)分子式)分子式AIAI2 2O O3 3简单,空间形态复杂,简单,空间形态复杂,8 8种以上的形态种以上的形态(3 3)同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径)同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径
9、分布、比表分布、比表 面积等存在差异面积等存在差异 (4 4)吸附量与含水量关系很大)吸附量与含水量关系很大制备:制备:由氢氧化铝加热脱水得到的。由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团:吸附基团:铝离子铝离子种类:种类:碱性:由氢氧化铝高温脱水,用于碱性稳定的溶质碱性:由氢氧化铝高温脱水,用于碱性稳定的溶质酸性:碱性氧化铝经盐酸洗涤,用于在酸性稳定的溶质酸性:碱性氧化铝经盐酸洗涤,用于在酸性稳定的溶质中性:碱性氧化铝经水洗后活化制得中性:碱性氧化铝经水洗后活化制得应用:应用:有机溶剂中分离天然成分有机溶剂中分离天然成分第18页,共136页,编辑于2022年,星期日第二讲层析分离法层析分离法第19页
10、,共136页,编辑于2022年,星期日硅胶硅胶层析分离法层析分离法第二讲硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质(1 1)化学组成)化学组成 SiOSiO2 2.XH.XH2 20 0,(2 2)属于无定形结构,基本结构质点为)属于无定形结构,基本结构质点为SiSi一一O O四面体,相互堆四面体,相互堆 积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。(3 3)硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。)硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。硅胶的分类硅胶的分类(常以
11、孔径大小来分),(常以孔径大小来分),(1)(1)特细孔硅胶特细孔硅胶 (0.8nm(0.8nm以下以下)。(2)(2)细孔硅胶(细孔硅胶(1.52.0nm)1.52.0nm)(3)(3)中孔硅胶中孔硅胶 (4.0(4.0一一5.0nm)5.0nm)(4)(4)粗孔硅胶粗孔硅胶 (10.nm(10.nm以上以上)应用:吸附层析剂与分配层析剂应用:吸附层析剂与分配层析剂 优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物,用于天然产物分离,物,用于天然产物分离,可用在水溶液中或有机溶剂中可用在水溶液中或有机溶剂中第20页,共136页,编辑于2022年,星期日琼脂糖琼脂糖层析分
12、离法层析分离法第二讲由海洋生物琼脂提取得到的主要成分由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 (1 1)中性不带电)中性不带电(2 2)水溶性线状多糖)水溶性线状多糖(3 3)高亲水性,含大量羟基)高亲水性,含大量羟基(4 4)能制成多孔性凝胶,分离大分子)能制成多孔性凝胶,分离大分子制备:制备:(1 1)去除带电琼胶成分)去除带电琼胶成分(2 2)将溶化的琼脂糖采用悬浮)将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。得珠状介质。(3 3)采用交联剂增加介质的机械强度)采用交联剂增加介质的机械强度第21页,共136页,编辑于2022年,星期日 琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝
13、胶结构琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a a 琼脂糖结构琼脂糖结构 b b 亲水性凝胶结构亲水性凝胶结构 第二讲层析分离法层析分离法第22页,共136页,编辑于2022年,星期日琼脂糖(琼脂糖(2 2)层析分离法层析分离法第二讲介质商品种类介质商品种类Sepharose 2B,Sepharose 2B,Sepharose 4B,Sepharose 4B,Sepharose 6BSepharose 6B。经过交联而增加机械强度的琼脂糖经过交联而增加机械强度的琼脂糖Sepharose CL-2B,Sepharose CL-2B,Sepharose CL-4B,Sepharose CL-4B,S
14、epharose CL-6B Sepharose CL-6B 应用应用 水溶液中分离蛋白质水溶液中分离蛋白质第23页,共136页,编辑于2022年,星期日葡聚糖葡聚糖 层析分离法层析分离法第二讲-1,6-1,6 相连的葡萄糖聚合物,由环氧氯丙烷交联得到珠粒相连的葡萄糖聚合物,由环氧氯丙烷交联得到珠粒性质:性质:(1 1)亲水性比琼脂糖高(羟基数多)亲水性比琼脂糖高(羟基数多)(2 2)化学稳定性及热稳定性好)化学稳定性及热稳定性好(3 3)孔度与机械强度与交联度有关)孔度与机械强度与交联度有关(4 4)用于凝胶过滤分子筛)用于凝胶过滤分子筛应用:应用:水溶液中分离蛋白质等水溶液中分离蛋白质等第
15、24页,共136页,编辑于2022年,星期日纤维素纤维素层析分离法层析分离法第二讲-1,4-1,4 相连的相连的D-D-葡萄糖(偶而有葡萄糖(偶而有1 1,6 6 键合)线性天然高聚键合)线性天然高聚物物(1 1)亲水)亲水(2 2)微晶与无定型两部分组成,缺乏孔度)微晶与无定型两部分组成,缺乏孔度大孔珠状纤维素大孔珠状纤维素(1 1)高孔度)高孔度(2 2)高机械强度)高机械强度(3)3)亲水性强亲水性强 应用:应用:离子交换分离蛋白质介质离子交换分离蛋白质介质第25页,共136页,编辑于2022年,星期日聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺层析分离法层析分离法第二讲性质:性质:(1 1)丙烯酰胺与交联剂)
16、丙烯酰胺与交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰甲叉双丙烯酰 胺共聚胺共聚(2 2)烷烃骨架与酰胺侧链)烷烃骨架与酰胺侧链(3 3)控制交联剂比例可控制网格孔度)控制交联剂比例可控制网格孔度(4 4)亲水好,但不如多糖介质)亲水好,但不如多糖介质 (5)(5)机械强度差机械强度差应用:应用:(1 1)凝胶过滤)凝胶过滤 (2 2)电泳介质电泳介质第26页,共136页,编辑于2022年,星期日亲和层析亲和层析 层析分离法层析分离法第二讲亲和层析亲和层析(Affinity Chromatography)(Affinity Chromatography)是利用生物体内存在是利用生物体内存在的特异性相互作
17、用的分子对而设计的层析方法。的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。生物体内相互作用的分子对:生物体内相互作用的分子对:(1)(1)酶酶底物或抑制剂底物或抑制剂(2)(2)抗原抗原抗体。抗体。(3)(3)激素激素受体。受体。(4)(4)糖蛋白与凝集素糖蛋白与凝集素,(5)(5)生物素生物素生物素结合蛋白等生物素结合蛋白等 第27页,共136页,编辑于2022年,星期日 基质活化方法与配基偶联基质活化方法与配基偶联 层析分离法层析分离法第二讲活活化化(activation):(activation):基基质质(matrixmatrix)上上的的化化学学基基团团是是不不活活泼泼的的,无无法法与与
18、配配基基直直接接偶偶联联,通通过过化化学学反反应应使使介介质质上上化化学学基基团团处处于活化状态。于活化状态。(1)(1)大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。(2)(2)小小分分子子配配基基,在在基基质质与与配配基基之之间间插插入入若若干干碳碳原原子子手手臂臂(spacer),(spacer),然后再与配基偶联。然后再与配基偶联。(3)(3)环环氧氧氯氯丙丙烷烷,1,41,4丁丁二二醇醇缩缩水水甘甘油油醚醚本本身身是是活活化化剂剂亦亦具有手臂作用。具有手臂作用。第28页,共136页,编辑于2022年,星期日活化方法(活化方法(1 1)层析分离法层
19、析分离法第二讲A A 溴化氰法溴化氰法溴溴化化氰氰在在碱碱性性条条件件下下与与多多糖糖上上的的羟羟基基反反应应导导入入氰氰酯酯键键或或亚亚氨氨碳酸酯到基质上碳酸酯到基质上,进而与配基偶联进而与配基偶联优点优点:(1 1)适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质(2 2)用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联)用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联(3 3)操作步骤简单)操作步骤简单,重现性好。重现性好。(4 4)偶联条件温和)偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。特别适用于偶联敏感性生物大分子。缺点:缺点:(1 1)形成的异脲键易产生非特异性
20、吸附)形成的异脲键易产生非特异性吸附,(2 2)共价键不稳定)共价键不稳定,配基容易脱落配基容易脱落,(3 3)活化操作危险性大,反应后的残余液需经处理再排放)活化操作危险性大,反应后的残余液需经处理再排放 第29页,共136页,编辑于2022年,星期日溴化氰活化与配基偶联化学反应式溴化氰活化与配基偶联化学反应式 第二讲层析分离法层析分离法第30页,共136页,编辑于2022年,星期日 活化方法(活化方法(2 2)层析分离法层析分离法第二讲B B 环氧氯丙烷活化环氧氯丙烷活化 (1 1)所形成的共价键稳定)所形成的共价键稳定,配基不易落脱配基不易落脱(2 2)自动引入手臂)自动引入手臂,(3
21、3)有更小的非特异性吸附)有更小的非特异性吸附,(4 4)活化操作简单易行)活化操作简单易行,危险性相对较小危险性相对较小缺点:缺点:在强碱性条件反应,不适用于碱敏感物质。在强碱性条件反应,不适用于碱敏感物质。第31页,共136页,编辑于2022年,星期日环氧氯丙烷活化反应式 第二讲层析分离法层析分离法第32页,共136页,编辑于2022年,星期日 环氧基的氨化及偶联配基反应环氧基的氨化及偶联配基反应 第二讲层析分离法层析分离法第33页,共136页,编辑于2022年,星期日思考题思考题层析分离法层析分离法第二讲1 1 常用的层析介质有哪些?各适用于何种状况下的分离?常用的层析介质有哪些?各适用
22、于何种状况下的分离?2 2 亲和层析的机理是什么?亲和层析的机理是什么?第34页,共136页,编辑于2022年,星期日层析法(第三讲)层析法(第三讲)第三讲层析分离法层析分离法第35页,共136页,编辑于2022年,星期日活化方法(活化方法(3)层析分离法层析分离法第三讲C C 对甲苯磺酰氯活化对甲苯磺酰氯活化 (1 1)用于活化含羟基基质)用于活化含羟基基质,将羟基转化为磺酰将羟基转化为磺酰 基基,在配基偶联后容易脱落在配基偶联后容易脱落,不引入电荷。不引入电荷。(2 2)配基与羟基间形成稳定化学键。)配基与羟基间形成稳定化学键。(3 3)活化操作需在无水丙酮环境中进行。偶联)活化操作需在无
23、水丙酮环境中进行。偶联 配基根据情况配基根据情况,既可在有机相中进行既可在有机相中进行,亦可在水亦可在水相中进行相中进行第36页,共136页,编辑于2022年,星期日对甲苯磺酰氯活化反应式第三讲层析分离法层析分离法第37页,共136页,编辑于2022年,星期日手臂(手臂(spacer)spacer)层析分离法层析分离法第三讲作用作用 :减少亲和作用空间位阻:减少亲和作用空间位阻 连接:通过化学反应与活化基团连接连接:通过化学反应与活化基团连接手臂化合物:手臂化合物:乙二胺乙二胺 NHNH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-NH-NH2 2已二胺已二胺 NHNH2 2-CH-CH2 2-
24、CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-NH-NH2 26-6-氨基已酸氨基已酸NHNH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-CH-CH2 2-COOH-COOH环氧氯丙烷环氧氯丙烷 1 1,4-4-丁二醇缩水甘油醚丁二醇缩水甘油醚第38页,共136页,编辑于2022年,星期日D D 残余电荷的掩蔽残余电荷的掩蔽层析分离法层析分离法第三讲目的:目的:防止产生非特异性吸附防止产生非特异性吸附原理:原理:通过化学反应消除基团上的电荷通过化学反应消除基团上的电荷方法:方法:(1 1)自发水解)自发水解(2 2)氨基:醋酸酐)氨基:醋酸酐(3 3)羧基:水溶性碳二
25、亚胺)羧基:水溶性碳二亚胺第39页,共136页,编辑于2022年,星期日手臂氨末端的掩蔽手臂氨末端的掩蔽 第三讲层析分离法层析分离法第40页,共136页,编辑于2022年,星期日残留羧基掩蔽反应残留羧基掩蔽反应 第三讲层析分离法层析分离法第41页,共136页,编辑于2022年,星期日E E 活化基团与配基密度测定活化基团与配基密度测定 层析分离法层析分离法第三讲方法:方法:(1 1)氨基或羧基可用酸碱滴定。)氨基或羧基可用酸碱滴定。(2 2)有紫外吸收特征的)有紫外吸收特征的,可用紫外分光法测定。可用紫外分光法测定。(3 3)通过测定反应余液中配基残留量推算(偶)通过测定反应余液中配基残留量推
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