《生化鉴定原理》PPT课件.ppt

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1、致病菌致病菌检测生化生化鉴定原理及定原理及应用用三糖三糖铁琼脂脂试验靛基靛基质试验ONPG试验甲基甲基红MR试验VP试验尿素尿素酶试验赖氨酸脱氨酸脱羟酶试验淀粉水解淀粉水解酶试验胆汁七叶苷水解胆汁七叶苷水解试验糖（醇、苷）糖（醇、苷）类发酵酵试验甘油复甘油复红试验葡萄糖酸氧化葡萄糖酸氧化试验氧化氧化发酵酵试验枸枸橼酸酸盐利用利用试验呼吸呼吸酶类试验硝酸硝酸盐还原原试验三糖三糖铁琼脂脂试验本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因

2、接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。三糖三糖铁琼脂脂试验 志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气。靛基靛基质试验某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的

3、色氨酸生成吲哚（靛基质），当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。半乳糖苷半乳糖苷酶试验（ONPG试验）原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠

4、杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。甲基甲基红（MR）试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在 5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。VP试验原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某

5、些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。尿素酶试验原理：某些细菌具有尿素酶，在含有尿素的培养基中，分解尿素产生氨，使培养基呈碱性，此时培养基中的酚红指示剂显红色。赖氨酸脱羟试验 赖氨酸脱酸主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，也可用于某些

6、非发酵菌。试验关培养基中含有赖氨酸和葡萄糖，酸碱指示剂为溴甲酚紫（中性和碱性时紫色，酸性黄色），未用时为紫色。如果待测细菌将赖氨酸脱羧，则产生胺，为碱性，溴甲酚紫保持紫色，如果不脱羧，肠杆菌科的细菌都能分解葡萄糖，产酸，溴甲酚紫变为黄色。氨基酸脱羧的对照管其实就是一个葡萄糖发酵管，不含氨基酸。由于实验结果阳性的为保持紫色不变，阴性结果为黄色，为保证结果的可靠性，须同时接种对照管，如对照管变为黄色，说明细菌接种成功，证实试验管紫色（不变色）却为阳性，而非未接种好细菌。此外，由于氨基酸脱羧的产物为尸胺、腐胺等，遇氧不稳定，故各管接种完细菌后，需加入几滴液体石蜡隔绝空气，保持胺的稳定性。淀粉水解淀粉

7、水解试验原理：产生淀粉酶的细菌能将淀粉水解为糖类，在培养基上滴加碘液时，可在菌落周围出现透明区。应用：用于白喉棒状杆菌生物型的分型，重型淀粉水解试验阳性，轻、中型阴性；芽胞杆菌属菌种和厌氧菌某些种的鉴定。胆汁七叶苷水解胆汁七叶苷水解试验原理：在10%40胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成的七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。应用：主要用于鉴别D群链球菌与其它链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌（如脆弱拟杆菌等）的初步鉴别。D群链球菌本试验为阳性。糖（醇、苷）糖（醇、苷）类发酵酵试验原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的

8、酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。甘油复甘油复红试验原理：甘油可被细菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脱去羧基为乙醛，乙醛与无色的复

9、红生成醌式化合物，呈深紫红色。应用：主要用于沙门菌属内各菌种间的鉴别。伤寒沙门菌、甲（丙）型副伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、孔道夫沙门菌和仙台沙门菌本试验为阴性，乙型副伤寒沙门菌结果不定，其它不常见沙门菌多数为阳性。葡萄糖酸氧化葡萄糖酸氧化试验原理：某些细菌可氧化葡萄糖酸钾，生成-酮基葡萄糖酸。-酮基葡萄糖酸是一种还原性物质，可与班氏试剂起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。应用：主要用于假单胞菌的鉴定和肠杆菌科菌分群。氧化氧化发酵酵试验原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡

10、萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或HughLeifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。枸枸橼酸酸盐利用利用试验原理：枸橼酸盐培养基系一综合性培养基，其中枸橼酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵是氮的唯一来源。有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源，能在培养基上生长，并且能分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色色变为深深蓝色色。不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不

11、生长，培养基不变色。呼吸呼吸酶类试验氧化酶试验原理：某些细菌具有氧化酶，能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化（先使细胞色素C氧化，电子传递体）成红色醌类化合物。该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科（阴性）与弧菌科（阳性）。触酶活力试验原理：具有触酶的细菌能催化过氧化酶，放出生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。方法：取3%过氧化氢0.5ml，滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上，或滴加到不含血液的肉汤培养物中，观察结果。结果：培养物出出现气气泡者泡者为阳性阳性。硝酸硝酸盐还原原试验原理：某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再与-萘胺结合，生成N-萘胺偶氮苯磺酸（红色）。氰化化钾实验 原理:氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌。