《荧光定量PCR》PPT课件.ppt
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1、荧光定量荧光定量PCRPCR技术部:张劲松荧光定量PCR技术发展史荧光定量PCR的概念 荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR与普通PCR比较 实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提
2、高了PCRPCR反应反应的特异性的特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控,精确定量全程监控,精确定量 结果分析更快捷方便,无需电泳结果分析更快捷方便,无需电泳 同一样品重复同一样品重复96次的实验结果次的实验结果普通普通PCR-终点检测终点检测:-终点产物量经过终点产物量经过PCR放大放大的的DNA量量-不恒定,误差大不恒定,误差大Q-PCR-起点检测起点检测:-具有重现性,误差小具有重现性,误差小 扩增曲线(primary curve)随着PCR反应的进行,扩增产物不断累积,荧光信号强度不断增加。每经过一个循环,收集一次荧光信号,通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化,从而得到扩
3、增曲线图。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线,而是呈S型曲线。纵坐标:Rn(荧光值)横坐标:cycle number(循环数)线性期荧光阈值(threshold)基线基线(baseline):一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光阀值荧光阀值(threshold):扩增曲线上人为设定的一个值扩增曲线上人为设定的一个值-缺省设置:PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍,(机器自动设置)。-手动设置:大于样本的荧光背景值手工调整荧光阈值示意图 Ct 值(Cycle Threshold)Ct值值:在荧光PCR扩增过程
4、中,当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值的特点:相同模板进行96次扩增,平台期DNA拷贝数波动很大,但Ct值相对固定;Ct值则极具重现性 起始拷贝数越多,经过的循环数就越少,Ct值也就越小,反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间,过大和过小都将影响实验数据的精度。Ct值可以确定初始模板量?u理想的理想的PCR反应:反应:X=X0*2nu非理想的非理想的PCR反应:反应:X=X0(1+Ex)n n:扩增反应的循环次数 X:第n次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率当当n=Ct时时 荧光定量荧光定量PCR应应用用l基础研究中基因表达定量的测定;基础研究中
5、基因表达定量的测定;l细胞因子的表达分析细胞因子的表达分析:mRNA表达量分析;l药物治疗、新药研究;药物治疗、新药研究;l遗传病的诊断:遗传病的诊断:点突变、插入基因、多基因等检测;l肿瘤耐药基因表达的研究:肿瘤耐药基因表达的研究:如p53基因、多药耐药相关蛋白(MRP)蛋白等检测;l临临床床医医疗疗领领域域病病原原体体和和基基因因诊诊断断:基因拷贝数定量、细菌和病毒、病原体的定量检测,如:确定病原体的数量判断感染程度,掌握用药时机、药物疗效观察乙肝病毒人乳头瘤病毒淋球菌结核杆菌沙眼衣原体解脲支原体荧光定量PCR检测方法染料标记:染料标记:SYBR Green I探针标记:探针标记:水解型探
6、针:水解型探针:TaqMan发夹型探针:发夹型探针:Molecular beacon (分子信标)(分子信标)(分子信标)(分子信标)SYBR Green I 工作原理lSYBR Green I 是是一种与双链一种与双链DNA小小沟结合的荧光染料。沟结合的荧光染料。lSYBR Green I只只与双链与双链DNA结合结合才能发出荧光。才能发出荧光。l荧光信号与双链荧光信号与双链DNA分子数成正分子数成正比,随着扩增产物增加而增加。比,随着扩增产物增加而增加。荧光信号强度与反应体系中荧光信号强度与反应体系中所有双链所有双链DNA分子成分子成正比正比。SYBR Green5353SGExcitat
7、ionSGSGSGSGEmissionSYBR Green I作用机理示意图 53535353SGSGSGSGSGEmissionEmissionExcitationExcitationSYBR Green I优缺点 优点:n 实验设计简单 -仅需设计两个引物n通用性好,成本低 -对DNA模板没有选择性n兼容熔解曲线 -鉴定有无PCR杂带、有无引物二聚体需要在反应结束时,对产物做融解曲线分析。需要在反应结束时,对产物做融解曲线分析。缺点:nSYBR Green与所有双链DNA结合-引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性-只能检测单一模板,无法进行多重检测n灵敏度低-适合于5000拷贝以上的基因定量
8、温度温度荧光强度荧光强度熔解曲线分析PCR过程结束后,将温度缓慢升高,此时双链DNA解链成为单链,内掺染料会被释放出来,荧光信号逐渐减弱。l将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)峰值代表斜率改变最大时的温度值,即Tm,其值与双链DNA的长度、GC%含量有关,可部分代表序列的特异性融解曲线分析,单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析,出现杂峰其他产物出现非特异性荧光,因此定量不准确 Taqman 工作原理l探针与靶序列配对探针与靶序列配对 (一段序列,两个基团,(一段序列,两个基团,5 报告基团、报告基团、3淬灭基团)淬灭基团)l完整的探针,报告基团完整的探针,报告基团R发射的荧光被淬灭
9、基团发射的荧光被淬灭基团Q淬淬灭,没有荧光产生。灭,没有荧光产生。l聚合酶的聚合酶的5外切酶活性,报告基团外切酶活性,报告基团R与淬灭基团与淬灭基团Q分离,分离,发射荧光发射荧光RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的荧光信号强度与结合探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitationTaqman 工作示意图工作示意图 Taqman法的优缺点 优点优点优点优点%高度特异性高度特异性%重复性好重复性好%灵敏度高灵敏度高%可进行多重定量可进行多重定量 缺点缺点缺点缺点%只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标
10、%委托公司标记,价格较委托公司标记,价格较高高%不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标(Molecular beaco)分子信标分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术总结技术总结方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR Green I 方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析,基因表达量的研究,转基因重组动植物的研究TaqMan 方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测,疾病耐药基因研究
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