第五章-体内药物分析ppt课件.ppt

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1、病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程药物分析药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程常用体内样品的制备与贮藏常用体内样品的制备与贮藏 1体内样品分析的处理体内样品分析的处理 2体内样品分析方

2、法与方法验证体内样品分析方法与方法验证 3典型体内药物分析应用典型体内药物分析应用4病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程熟悉：熟悉：体内样品的采集与制备方法体内样品的采集与制备方法 体内样品分析方法验证的技术要求体内样品分析方法验证的技术要求 了解：了解：体内药物分析的性质与意义体内药物分析的性质与意义 掌握：掌握：体内药物分析的特点和应用体内药物分析的特点和应用 体内样品处理体内样品处理 体内样品分析方法验证的

3、内容体内样品分析方法验证的内容 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程概述概述体内药物分析体内药物分析生物分析生物分析4方法建立方法建立与验证与验证净化与浓集净化与浓集原形、代原形、代谢物谢物体液或组织体液或组织色谱、免疫分析、生物色谱、免疫分析、生物 完整、部分和交叉验证完整、部分和交叉验证 原形药物或其代谢物原形药物或其代谢物 缀合物、蛋白结合物缀合物、蛋白结合物 体内样品体内样品存在形式存在形式样品制备样品制

4、备分析方法分析方法蛋白沉淀、萃取、膜分离蛋白沉淀、萃取、膜分离水解、化学衍生化水解、化学衍生化血液是最常用样品血液是最常用样品尿液、唾液、头发和脏器尿液、唾液、头发和脏器病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程体内药物分析的特点体内药物分析的特点主要来自于主要来自于体内样品的特点体内样品的特点特点特点1.体内样品的特点体内样品的特点（1）采样量少：）采样量少：mll级；级；且不易重新获得且不易重新获得（2）待测物浓度

5、低：）待测物浓度低：g/ml ng/ml级，级，甚至甚至pg/ml（3）干扰物质多：）干扰物质多：尤其是血样和组织中的蛋白质尤其是血样和组织中的蛋白质 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2.体内药物分析的特点体内药物分析的特点（1）样品需经分离与浓集，）样品需经分离与浓集，或化学衍生化处理或化学衍生化处理（2）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高（3）分析工作量大，）分析工作量

6、大，数据处理和结果阐明繁杂数据处理和结果阐明繁杂 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第一节第一节常用体内样品的制备与储存常用体内样品的制备与储存 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程体内样品的种类体内样品的种类1体内样品的采集与制

7、备体内样品的采集与制备 2体内样品的储存与处理体内样品的储存与处理 3病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、体内样品的种类一、体内样品的种类体液体液组织组织排泄物排泄物血液、唾液血液、唾液脑脊液、胃液、脑脊液、胃液、胆汁、乳汁、胆汁、乳汁、精液、泪液精液、泪液尿液尿液粪便、粪便、汗液汗液胃、肠、肝、胃、肠、肝、肾、肺、脑、肾、肺、脑、肌肉、头发肌肉、头发体内样品体内样品病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体

8、内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、体内样品的采集与制备二、体内样品的采集与制备1.血样的采集血样的采集 静脉，静脉，0.25ml，15%20%动物总血量动物总血量 2.血浆的制备血浆的制备 抗凝剂，抗凝剂，1000 g离心离心510分钟，淡黄色上清液分钟，淡黄色上清液 3.血清的制备血清的制备 30分钟分钟1小时，小时，1000 g离心，离心，510分钟，上层淡分钟，上层淡黄色液体黄色液体 4.全血的制备全血的制备抗凝剂，抗凝剂，不离心不离心血样血

9、样50%60 20%40 常见体内样品常见体内样品病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1.尿样的特点尿样的特点原形或代谢物原形或代谢物药物浓度较高药物浓度较高收集量大（收集量大（15L）2.尿样的采集尿样的采集自然排尿自然排尿规定时间段（规定时间段（68小时）（时间尿）小时）（时间尿）3.尿样的储存尿样的储存 加入适当防腐剂加入适当防腐剂 尿样尿样病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在

10、一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程TDM（治疗药物监测）测定（治疗药物监测）测定S（唾液浓度）代替（唾液浓度）代替P（血浆游离浓度）进行临床监测（血浆游离浓度）进行临床监测 1.唾液的组成唾液的组成腮腺、舌下腺和颌下腺腮腺、舌下腺和颌下腺 2.唾液的采集唾液的采集漱口漱口15分钟，分钟，安静状态，安静状态，自然流出的唾液自然流出的唾液物理或化学方法刺激物理或化学方法刺激 3.样品的制备样品的制备3000r/min离心离心10分钟，上清液分钟，上清液 唾液唾液病原体侵入机体，消

11、弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1.样品的制备样品的制备制成水性基质匀浆溶液制成水性基质匀浆溶液 2.样品的处理样品的处理（1）沉淀蛋白法）沉淀蛋白法（2）酸）酸/碱水解法碱水解法（3）酶水解法）酶水解法蛋白水解酶中的枯草菌溶素蛋白水解酶中的枯草菌溶素 组织组织病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定

12、性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程三、体内样品的储存与处理三、体内样品的储存与处理短期保存：短期保存：冰箱（冰箱（4）冷藏）冷藏长长期保存：期保存：冷柜（冷柜（-20/-70-80）冷）冷冻冻，小体小体积积分装分装1.血血浆浆/血清血清 分离（分离（2小小时时），），硬硬质质玻璃玻璃/聚乙聚乙烯烯管（管（EP），），冷冷冻冻2.尿尿样样 冷藏（冷藏（2436小小时时）加防腐）加防腐剂剂3.唾液唾液 冷冷冻冻保存保存时时，解解冻冻后充分后充分搅搅匀后再用匀后再用（一）冷藏与冷冻（一）冷藏与冷冻病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引

13、起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程采样后立即终止酶的活性采样后立即终止酶的活性常用方法：液氮速冻，常用方法：液氮速冻，微波照射，微波照射，匀浆及沉淀，匀浆及沉淀，加酶加酶活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素C），调节），调节pH及样品煮沸及样品煮沸（二）去活性（二）去活性病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖

14、，引起不同程度的病理生理过程l酯酶抑制剂酯酶抑制剂，可，可以有效防止药物在以有效防止药物在酯酶的作用下发生酯酶的作用下发生降解降解哌唑嗪、敌敌畏哌唑嗪、敌敌畏噻吩甲酰三氟丙酮噻吩甲酰三氟丙酮 二乙异丙嗪二乙异丙嗪5,5-二硫代双二硫代双（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）氟化钠氟化钠氟化钾氟化钾敌敌畏敌敌畏酯酶是普遍存在于全血、酯酶是普遍存在于全血、血浆和血清中的一类水血浆和血清中的一类水解酶，能够水解结构中解酶，能够水解结构中含有酯键的药物含有酯键的药物 羧酸羧酸酯酶酯酶乙酰胆乙酰胆碱酯酶碱酯酶磷酸二磷酸二酯酶酯酶芳香基酯芳香基酯酶酶丁酰胆丁酰胆碱酯酶碱酯酶去活性：去活性：酶酶活性阻断活性阻断剂剂

15、病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程酯类酯类酰胺类酰胺类内酰胺类内酰胺类内酯类内酯类葡糖苷酸类葡糖苷酸类调节调节调节调节pHpH有效有效有效有效避免化合物发避免化合物发避免化合物发避免化合物发生降解或者分生降解或者分生降解或者分生降解或者分子内转化子内转化子内转化子内转化甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液去活性：调节去活性：调节pH病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机

16、体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程测定利福平时加入测定利福平时加入0.5%w/v的维生素的维生素C测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）含有酚羟基结含有酚羟基结构的药物在生构的药物在生物基质或样品物基质或样品处理过程易发处理过程易发生自身氧化生自身氧化使用抗氧化剂使用抗氧化剂为常用的方法为常用的方法去活性：抗氧化剂去活性：抗氧化剂病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏

17、机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第二节第二节体内样品处理体内样品处理 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程分析方法与样品处理步骤的选择分析方法与样品处理步骤的选择病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生

18、理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程体内样品处理的目的体内样品处理的目的1常用体内样品处理方法常用体内样品处理方法 2样品样品处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好条件条件样品样品处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的

19、病理生理过程一、体内样品处理的目的一、体内样品处理的目的仪器污染，劣化仪器污染，劣化（去蛋白）（去蛋白）提高测定灵敏度提高测定灵敏度/选择性选择性化学改性（衍生化）化学改性（衍生化）血浆蛋白结合物、缀合物血浆蛋白结合物、缀合物使待测药物使待测药物/代谢物代谢物释放释放测定药测定药物物/代谢物代谢物总浓度总浓度 1.使待测使待测组分游离组分游离 2.满足测满足测定方法的定方法的要求要求 3.改善分改善分析环境析环境 样品介质组成复杂：样品介质组成复杂：分离分离待测组分浓度低：待测组分浓度低：浓集浓集 样品样品处理处理病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁

20、殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、常用体内样品处理方法二、常用体内样品处理方法 蛋白沉淀法蛋白沉淀法 分离与浓集法分离与浓集法 缀合物水解法缀合物水解法 （一）（一）（二）（二）（三）（三）化学衍生化法化学衍生化法 （四）（四）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（一）去除蛋白质法（一）去除蛋白质法加入与

21、水混溶的有机溶加入与水混溶的有机溶剂，剂，蛋白析出，药物蛋白析出，药物释放释放乙腈、甲醇、丙酮、四乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等氢呋喃等 血浆血浆/血清与有机溶剂血清与有机溶剂的体积比的体积比1（23）饱和硫酸铵、硫酸钠、饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠等硫酸镁、氯化钠等血清与饱和硫酸铵溶液血清与饱和硫酸铵溶液的体积比为的体积比为1 2 1.1.溶剂沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法溶剂沉淀法2.2.中性盐析法中性盐析法中性盐析法中性盐析法病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对

22、稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程10%三氯醋酸或三氯醋酸或6%高氯高氯酸溶液酸溶液血清与强酸的体积比血清与强酸的体积比1 0.6上清液呈强酸性上清液呈强酸性（pH4）酸性下分解的药物不宜用酸性下分解的药物不宜用 热变性蛋白质沉淀热变性蛋白质沉淀通常通常90方法简单方法简单只能除去热变性蛋白只能除去热变性蛋白待测物热稳定性良好待测物热稳定性良好 3.3.强酸沉淀法强酸沉淀法强酸沉淀法强酸沉淀法 4.4.热凝固法热凝固法热凝固法热凝固法 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御

23、机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（二）分离与浓集法（二）分离与浓集法液相萃取法液相萃取法固相萃取法固相萃取法 超滤法超滤法1.2.3.病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1.液相萃取法液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的选择原则溶剂的用量溶剂的用量 水相的水相的pH（1）（2）（3）提取操作提取操作（4）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在

24、一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（1）溶剂的选取原则）溶剂的选取原则1）对药物分子未电离形式可溶，）对药物分子未电离形式可溶，对电离形式不溶；对电离形式不溶；2）沸点低，易挥发沸点低，易挥发；3）与水不相混溶与水不相混溶；4）无毒，）无毒，不易燃烧；不易燃烧

25、；5）具有化学稳定和惰性；）具有化学稳定和惰性；6）不影响紫外检测）不影响紫外检测 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程1）辅助试剂的使用）辅助试剂的使用乙醚萃取可混入约乙醚萃取可混入约1.2%水：水：加入固体氯化钠加入固体氯化钠2）混合溶剂的使用）混合溶剂的使用正己烷正己烷-异丙醇（异丙醇（95 5）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病

26、原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程溶溶剂剂紫外截止波紫外截止波长长（nm）沸点沸点（）极极性性增增加加正己正己烷烷21069环环己己烷烷21081甲苯甲苯285111异丙异丙醚醚*22068乙乙醚醚*22035乙酸戊乙酸戊酯酯285149三三氯氯甲甲烷烷24561甲基异丁基甲基异丁基酮酮230116乙酸乙乙酸乙酯酯26077正丁醇正丁醇215118*：含过氧化物；：含过氧化物；：肝脏毒性，肝脏毒性，有致癌作用有致癌作用 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理

27、生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（2）溶剂的用量）溶剂的用量有机相与水相（样品）体积比为有机相与水相（样品）体积比为1151碱性药物碱性药物pH高于高于pKa 12pH单位单位酸性药物酸性药物pH低于低于pKa 12pH单位单位碱性药物在碱性碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性，酸性药物在酸性pH基质中提基质中提取；取；多在碱性下提取，多在碱性下提取，可减少内源性物质（酸性）的可减少内源性物质（酸性）的干扰干扰碱性下不稳定，碱性下不稳定，在中性用三氯甲烷和异丙醇提取在中性用三氯甲烷和异丙醇提取（3）水相的）水相

28、的pH病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一般只提取一般只提取1次次若提取回收率较低（低于若提取回收率较低（低于50%），），提取提取23次次脂溶性干扰物，脂溶性干扰物，可进行小体积水溶液反提取可进行小体积水溶液反提取（4）提取操作）提取操作 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，

29、且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程2.固相萃取法固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法的原理 固相萃取法操作步骤固相萃取法操作步骤 注意事项注意事项（1）（2）（3）固相萃取法的特点固相萃取法的特点（4）自动化固相萃取自动化固相萃取（5）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（1）固相萃取法的原理）固相萃取法的原理含药物体内样品通过小柱时，含药物体内样品通过小柱时，受到受到“吸附吸附”、“分配分配”、“

30、离子交换离子交换”或其他亲和力作用，或其他亲和力作用，药物及内源性物药物及内源性物质同时被保留在固定相（填料）上质同时被保留在固定相（填料）上洗脱方式有两种：洗脱方式有两种：药物比干扰物质与固定相之间的亲药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强：冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留，和力更强：冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留，然后再然后再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；干扰物质较药干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强：药物直接被洗脱，物与固定相之间的亲和力更强：药物直接被洗脱，干扰干扰物被保留物被保留病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在

31、一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（2）固相萃取法操作步骤）固相萃取法操作步骤第第1步步：甲醇润湿小柱，甲醇润湿小柱，活活化填料；化填料；净化填料净化填料第第2步步：水水/缓冲液冲洗小柱，缓冲液冲洗小柱，去除甲醇；去除甲醇；甲醇含量过低甲醇含量过低（低于（低于

32、5%）致）致C18链弯曲折链弯曲折叠，叠，回收率降低回收率降低第第3步步：加样，加样，使样品通过使样品通过小柱，小柱，并弃去滤过液并弃去滤过液,平衡平衡病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程,平衡平衡第第4步步：水水/缓冲液冲洗缓冲液冲洗小柱，小柱，去除内源性及其去除内源性及其他干扰物质他干扰物质第第5步步：洗脱溶剂洗脱洗脱溶剂洗脱待测物，待测物，收集洗脱液收集洗脱液病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境

33、的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（3）注意事项）注意事项1）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在12ml/min；2）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损失失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；3）萃取碱性药物时，）萃取碱性药物时，洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、醋酸铵或离子对试剂醋酸

34、铵或离子对试剂 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（4）固相萃取法的特点）固相萃取法的特点当采用亲脂性键合硅胶当采用亲脂性键合硅胶SPE时时方便、省时方便、省时通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200300l）完全洗脱药物，净化并浓集样品完全洗脱药物，净化并浓集样品不需蒸干即可直接进样不需蒸干即可直接进样病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在

35、一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（5）自动化固相萃取法）自动化固相萃取法对于单个样品处理，对于单个样品处理，SPE操作省时操作省时对于大量样品的处理对于大量样品的处理半自动半自动SPE：萃取过程机械化萃取过程机械化全自动化仪器：全自动化仪器：通过柱切换技术实现固相萃取与通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用联用病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对

36、稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生

37、理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程柱切换：柱切换：固相萃取固相萃取-LC/MS/MS（5）自动化）自动化固相萃取法固相萃取法病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程3.超滤法超滤法ultrafiltration是一种膜分离技术是一种膜分离技术按照截留分子量，选择半透膜，可分离按照截留分子量，选择半透膜，可分离30 1000kD的可溶性生

38、物大分子的可溶性生物大分子无化学试剂，无相变化无化学试剂，无相变化简便，简便，游离药物分析的首选方法；游离药物分析的首选方法；尤其适合尤其适合TDM病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机

39、体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（三）缀合物水解法（三）缀合物水解法简便，简便，快速快速水解过程中发水解过程中发生药物分解生药物分解专一性较差专一性较差葡萄糖醛酸苷酶或葡萄糖醛酸苷酶或（和）硫酸酯酶（和）硫酸酯酶专属性强专属性强时间较长时间较长可引入黏蛋白可引入黏蛋白溶剂萃取过程中溶剂萃取过程中缀合物（尤其硫缀合物（尤其硫酸酯）直接分解酸酯）直接分解测定尿药总量、水解缀合物或测定尿药总量、水解缀合物或相代谢产物相代谢产物

40、趋向于直接测定缀合物趋向于直接测定缀合物 1.1.酸水解法酸水解法酸水解法酸水解法2.2.酶水解法酶水解法酶水解法酶水解法 3.3.溶剂解法溶剂解法溶剂解法溶剂解法 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（四）化学衍生化法（四）化学衍生化法药物分子中含有活泼氢者均可被化学药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化，如含有衍生化，如含有R-COOH、R-OH等等官能团的药物官能团的药物 GC：提高药物的挥发性；提高药物的

41、挥发性；增加药物的稳定性；增加药物的稳定性；生成非对生成非对映异构体映异构体 HPLC：提高检测灵敏度；提高检测灵敏度；改善色谱分离改善色谱分离 化学化学衍生化衍生化病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 1.在在GC中的应用中的应用（1）硅烷化）硅烷化：三甲基硅烷（：三甲基硅烷（TMCS）（2）酰化）酰化：三氟乙酸酐（：三氟乙酸酐（TFAA）（3）烷基化）烷基化：碘庚烷（：碘庚烷（C7H15I）（4）不对称衍生化

42、）不对称衍生化：（：（S）-N-三氟三氟 乙酰脯氨酰氯（乙酰脯氨酰氯（ST-FPC）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 2.在在HPLC中的应用中的应用（1）衍生化的分类）衍生化的分类柱前柱前/柱后；在线柱后；在线/离线离线（2）衍生化方法）衍生化方法 1）紫外衍生化）紫外衍生化 2）荧光衍生）荧光衍生化化3）质谱检测衍生化）质谱检测衍生化 4）非对映体衍生化非对映体衍生化病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏

43、机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程第三节第三节体内样品分析方法体内样品分析方法与方法验证与方法验证病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、分析方法的建立一、分析方法的建立二、分析方法的验证二、分析方法的验证 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性

44、，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程一、分析方法的建立一、分析方法的建立分析方法的选择分析方法的选择分析方法建立的一般程序分析方法建立的一般程序（一）（一）（二）（二）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（一）分析方法的选择（一）分析方法的选择 HPLC，GC LC-MS、LC-MS/MS、

45、GC-MS内源性物质、大多数小分子及部内源性物质、大多数小分子及部分生物大分子药物的药代动力学分生物大分子药物的药代动力学常用的检测方法：常用的检测方法：色谱分析法、免疫分析法和生物学色谱分析法、免疫分析法和生物学方法方法 病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程 RIA、EIA、FIA TDM及生物大分子的药代动力学及生物大分子的药代动力学应用较多应用较多抗生素生物利用度、生物等效性、抗生素生物利用度、生物等效性、

46、TDM 微生物学方法一般特异性较差微生物学方法一般特异性较差应用较少，可用于抗生素类药物的分析应用较少，可用于抗生素类药物的分析病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（二）分析方法建立的一般程序（二）分析方法建立的一般程序 待测物、内标（必要时）的对照待测物、内标（必要时）的对照标准物标准物色谱柱（填料）、流动相、流速、色谱柱（填料）、流动相、流速、进样量进样量 分析方法的建立和验证过程系同步进行分析方法的建立和验

47、证过程系同步进行 为便于讨论，为便于讨论，以色谱分析法为例分别叙述以色谱分析法为例分别叙述1.色谱条件色谱条件 的筛选的筛选病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程试剂与溶剂试验试剂与溶剂试验生物基质试验生物基质试验质控样品试验质控样品试验代谢产物对待测物、内标物的干扰代谢产物对待测物、内标物的干扰配伍用药的干扰配伍用药的干扰2.色谱条件色谱条件 的优化的优化3.试验样品试验样品 的测试的测试病原体侵入机体，消弱机体

48、防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程二、分析方法的验证二、分析方法的验证选择性选择性标准曲线与定量范围标准曲线与定量范围定量下限定量下限 （一）（一）（二）（二）（三）（三）精密度与准确度精密度与准确度 （四）（四）样品稳定性样品稳定性（五）（五）提取回收率提取回收率（六）（六）基质效应基质效应（七）（七）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机

49、体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程试验样品分析试验样品分析试验样品浓度超出定量范围的处理试验样品浓度超出定量范围的处理作为外源性药物使用的内源性物质的测定作为外源性药物使用的内源性物质的测定 （八）（八）（九）（九）（十）（十）微生物微生物/免疫学方法的验证免疫学方法的验证（十一）（十一）名词解释名词解释（十二）（十二）病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程病原体侵入机体，消弱机体防御机能，破坏机体内环境的相对稳定性，且在一定部位生长繁殖，引起不同程度的病理生理过程（一

50、）选择性（一）选择性比较待测物的对照标准比较待测物的对照标准物质与物质与6个不同个体的空个不同个体的空白生物基质和白生物基质和QC样品样品软电离质谱（软电离质谱（LC-MS或或LC-MS/MS）基质效应）基质效应 比较比较QC样品和至少样品和至少6个不个不同个体用药后的试验样品同个体用药后的试验样品 必要时必要时HPLC-DAD和LC-MS确证峰的单一确证峰的单一/同一同一 性性 选择性选择性（selectivity），体内样品所含其他物质不得），体内样品所含其他物质不得干扰对样品的测定或者其干扰在分析方法的可接受范干扰对样品的测定或者其干扰在分析方法的可接受范围内。围内。1.1.内源性物质内