人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件.ppt

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1、烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析中南大学生命科学学院2 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 2 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第一节 实验目的掌握人类基因组DNA提取的基本原理和方法掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA方法3 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 3 烧伤病人的治疗

2、通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节 实验原理4 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人相关知识核酸提取思路：q 破膜：细胞膜、核膜破膜：细胞膜、核膜 q 分离：通过酶，有机溶剂，调节分离：通过酶，有机溶剂，调节pHpH值，离心等值，离心等q 纯化：去除杂质纯化：去除杂质5 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人DNA提取原则：q 保证保证

3、DNADNA一级结构的完整性一级结构的完整性q 排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高 排除有机溶剂和金属离子的污染排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染排除其他核酸分子的污染相关知识6 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人样品来源：q 培养细胞培养细胞q 组织标本组织标本q 血液样本血液样本相关知识7 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮

4、肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人实验原理用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。8 第一节实验原理烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人离心吸附

5、柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗液将杂质去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液或去离子水将DNA从硅基质膜上洗脱。高盐，低pH值：选择性结合DNA漂洗低盐，高pH值：DNA从硅基质膜上洗脱9 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 9 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节 主要试剂10 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人主要试剂

6、 q 培养细胞培养细胞q RNase A RNase A（100mg/ml100mg/ml）q ProteaseProteaseqBuffer GRBuffer GRq Buffer GLBuffer GLq 无水乙醇无水乙醇q Buffer GW1Buffer GW1q Buffer GW2Buffer GW2q Buffer GEBuffer GE11 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 11 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 主要仪器12 烧伤

7、病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人微量移液器微量移液器台式微量离心机台式微量离心机 电泳仪电泳仪 凝胶成像系统凝胶成像系统主要仪器LIFELIFE13 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 13 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第五节 操作步骤14 LOGOLIFELIFE烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同

8、学们想一想如何来治疗该病人 1.样品处理：取1管细胞，做好标记，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞。3.向以上溶液中加入20 l Protease K，混匀。4.加入200 l Buffer GL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1分钟。注意：不要直接将Protease直接加入到Buffer GL。5.56孵育10分钟，其间颠倒混匀数次6.加入200 l无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上 的液体集中到管底。第五节操作步骤7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新

9、放回收集管中。2.加入200l GR，用移液器反复吸打几次，使细胞悬浮。15 LOGOLIFELIFE烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人10.吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入60l Buffer GE，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20保存DNA。7.向吸附柱中加入500 l Buffer GW1，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。8.向吸附柱中加入500 l Buffer GW2，12,000 rpm

10、离心1分钟，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中。9.10,000 rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。第五节操作步骤11.取5-10l基因组DNA，并加入2 l上样缓冲液，混匀，加样到1琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。16 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 16 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第六节 注意事项17 LOGOLIFELIFE烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤

11、病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人（1）试剂配制及保存规范，离心管及试剂配制及保存规范，离心管及TipTip头需经高压灭菌处理。头需经高压灭菌处理。（2）基因组基因组DNADNA长而弯曲，易断裂。操作过程中长而弯曲，易断裂。操作过程中尽量轻缓尽量轻缓，避免过度的，避免过度的 溶液吹打转移，以及过高的温度。溶液吹打转移，以及过高的温度。第六节注意事项18 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSITION PAGE 18 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第七节

12、结果分析19 LOGOLIFELIFE烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第七节结果分析量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。质量：质量：a.纯度越纯越好。纯度越纯越好。A260/A280越接近越接近1.8越好越好 b.分子量越大越好。分子量越大越好。DNA分子量大于分子量大于30KB，可满足一般实验要求。，可满足一般实验要求。1.0的琼脂糖凝胶电泳，的琼脂糖凝胶电泳，理想电泳结果理想电泳结果:靠近点样孔，落后于靠近点样孔，落后于Marker最后一条区带最后一条区带(约约

13、21KB)的位置的位置可见一条明亮的区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散的小可见一条明亮的区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散的小分子量区带（分子量区带（RNA）。）。20 LOGO烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人M:DNA/HindIII+EcoRI DNA Marker；1-5:基因组DNA基因组基因组DNADNA的琼脂糖凝胶电泳结果图的琼脂糖凝胶电泳结果图第七节结果分析LIFELIFE21226 bpM1234521 LOGOContents Page目录页 子目录 TRANSI

14、TION PAGE 21 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人课程相关资源22 LOGOLIFELIFE烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人课程简介课程简介医学分子生物学-国家精品资源共享课，2013（http:/202.197.64.71:4505/）医学分子生物学-国家精品课程(本科），2008（http:/ LOGO烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人谢谢！0731-8480 5449