(第八章)第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件.ppt

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1、第十章第十章 植物原生质体培养与体细胞杂交 授课老师：授课老师：韦鹏霄烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第十章第十章 植物原生质体培养与体细胞杂交o第一节第一节 植物原生质体的定义及特点o第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o第三节第三节 植物原生质体培养方法o第四节第四节 体细胞杂交烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第一节第一节 植物原生质体的定义及特点o1、植物原生质体原生质体的定义定义o植物原生质体（

2、植物原生质体（plant protoplast）：o 是指已脱除细胞壁的具有生活力的裸露的植物细胞。o 植物原生质体植物原生质体（protoplast）一词始用于Hanstein（1880），是指“通过质壁分离，能够和细胞壁分离的那部分细胞物质。”换言之，原生质体就是除去全部细胞壁的“细胞”，或原生质膜所包围的“裸露细胞”。o 原生质体原生质体是指由细胞壁质膜所包裹起来的一个具有细胞原有的全部原生质及由它所构成的各种细胞器的一个“整体或单位”。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第一节第一节 植物原生质体

3、的定义及特点o2、离体原生质体原生质体的特点特点（7点）o经离体的原生质体原生质体有如下几个特点：o（1）能够完全分离，便于操作控制。o 在悬浮液中完全分离，每个原生质体可看作一个纯粹单细胞，易于定量操作和控制。o（2）原生质体原生质体的性能接近原细胞水平。o 在RNA和蛋白质合成能力及光合活性与原组织中的细胞水平接近。o（3）能再生胞壁、分裂增殖和再生完整植株。o（4）能同源同源或异源融合融合，为体细胞杂交材料。o 在诱导条件下，发生同源或异源融合，形成聚核体聚核体或杂核体杂核体。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如

4、何来治疗该病人第一节第一节 植物原生质体的定义及特点o（5）能摄取摄取外来物质外来物质，可作遗传转化工具。o 外来物质外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的理想工具。o（6）变异为单细胞单细胞，变异性状易纯。o 原生质体原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更纯。o（7）易被破坏，便于内含物分离。o 内含物内含物如核酸、蛋白质，酶等高分子物质及胞核、叶粒体、线粒体、液泡和膜等。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病

5、人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o1、植物原生质体原生质体培养培养的发展简史o 从高等植物中分离原生质体原生质体的研究最早是Klercker在1892年进行的。当时他所用的主要是“机械法机械法”，即把细胞置于一种适当的质壁分离介质中，然后用利刃切割。在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。在某些贮藏组织中，如萝卜的根、黄瓜的中皮层等，应用这个方法可从它们高度液泡化的细胞中分离出原生质体。然而这个方法有明显的缺缺点点：一一是产量很低；二二是在由分生细胞和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体原生质体时不适用。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤

6、进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o 1960年，Cocking证实了用“酶解法酶解法”由高等植物细胞中大量分离原生质体原生质体的可能性。他使用了一种由疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液以降解细胞壁，然而进一步的研究只是到了有商品酶供应之后才成为可能。自从1968年纤维素酶和离析酶投入市场后，植物原生质体原生质体培养培养才变成了一个热门的研究领域。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同

7、学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o 首先，用商品酶进行原生质体原生质体分离的是（Takebe）等（1968）。他们在分离烟草烟草叶肉原生质体的程序中，依次使用上述两种酶。即先用离析酶处理叶片小块，使之释放出单个细胞，然后再以纤维素酶消化掉细胞壁，释放出原生质体。o Power和Cocking（1968）证实，这两种酶也可以一起使用，这种“同时处理法同时处理法”或“一步法”比“顺序处理法”快，并且由于减少了步骤，也就减少了微生物污染的机会。现在，多数研究都使用这种简化的“一步法”。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，

8、健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o 1971年，Takebe首次利用烟草叶片分离原生质原生质体，并获得了再生植株。以后，随着各种商品酶的出现，植物原生质体培养原生质体培养取得了突飞猛进的发展。在作物上，如大豆（Wei和Xu,1988）、棉花（陈志贤等，1989）油菜（Spangenberg等，1986）等重要经济作用已成功地从原生质体再生成植株。o 特别是一直认为难以培养的禾谷类作物禾谷类作物，例如，水稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987；Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海波等，198

9、9）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱的原生质体培养原生质体培养都已相继成功。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o 木本植物原生质体培养原生质体培养的进展也很迅速。科学家们相继在柑桔（Vardi等，1982）、檀香（Rao等，1984）、杨树（Russel和Mocown，1988）、云杉（Attree等，1989）等木本植物上获得成功。据统计，目前已从分属49个科、160多个属的360多种植物的原生质体培养原生质体培养中获得了再生植株，未获再生植株的再生质体

10、培养还有许多植物。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o 原生质体的培养技术原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功（Spangenberg等，1986）。o 利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原原生质体生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究也是有利的（Schweigo等，1987）。o 饲养层培养法可大大提高水稻水稻（Kyozu等，1987）、玉米玉

11、米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂（Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程的观察。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o2、植物原生质体培养原生质体培养的意义意义o（1）植物原生质体培养原生质体培养用于作物改良o 在作物改良上，常规育种常规育种至今还起着重要的作用。但常规育种有一定的局限性。通过原生质体融合原生质体融合后再生的杂种植株，可以克服远缘杂交中的不亲和性和子代不育等常规远缘

12、杂交所难以克服的障碍。也有实验说明，通过体细胞杂交体细胞杂交能转移在作物杂交育种上十分有价值的细胞质雄性核不育基因。这些都给农作物的改良带来了新的方法和希望。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o（2）植物原生质体原生质体是植物遗传工程的理想受体o 原生质体原生质体由于没有细胞壁，可以直接吸收外源DNA，这就可能有目的地引入特定的有用基因，来定向地改造现有生物体的性状，包括农作物的产量性状和品质性状。o 特别是对于单子叶植物，由于缺乏天然的基因载体，在基因转化过程

13、中，无法采用双子叶植物双子叶植物的基因转化系统。这样，原生质体原生质体就成了理想的受体。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o（3）植物原生质体原生质体用于细胞器的分离与转移。o 分离的原生质体由于没有细胞器的障碍，可以进行许多遗传操作研究。用原生质体原生质体作材料可以分离制备细胞内的各种细胞器细胞器，如叶绿体、线粒体、细胞核和染色体等。这对于研究这些细胞器的结构、功能、生理生化特性，以及进行分子生物学分析十分方便。o 原生质体原生质体摄取了这些物质之后，其遗传结

14、构和功能有可能也会发生相应的改变，经培养再生的植株会出现一些新的性状，并能遗传下去，这就为植物优良性状的筛选和品质改良提供了丰富的源泉。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第二节第二节 植物原生质体培养的发展与意义o（4）植物原生质体原生质体用于有关理论研究。o 植物原生质体原生质体由于只有细胞膜包裹，可以用来研究细胞壁的再生、细胞膜的离子转动以及病毒侵染的机理等问题。由于原生质体在人工培养的条件下，可以再生细胞壁，进而产生植株，故可以深入探讨再生壁的生物化学特性，以及培养条件下对于再生壁的原材料的合成、

15、运输与装配的影响。o 近30年来，植物原生质体研究原生质体研究不仅已成为细胞生物学、生物技术等学科中发展较快的一个分支。而且通过多方向的探索，原生质体培养技术原生质体培养技术已在生理学、遗传学、病理学、病毒学和育种学等研究中得到了广泛应用。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o一、植物原生质体原生质体的分离分离o（一）植物原生质体原生质体的分离方法o 主要有机械法和酶法酶法两种：o1、机械法分离原生质体原生质体o（1）步骤：分2步o 第一步：是将植物组织或细胞置于高渗糖浓

16、液中，让细胞产生质壁分离；o 第二步：用“机械法”磨碎组织或切破细胞壁，让原生质体释放出来。o（2）优缺点优缺点o优点优点：可排除外加酶对原生质体结构和代谢活性的有害影响。o缺点缺点：原生质体产量太低，而且对难以产生质壁分离的分生细胞无能为力。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o2、酶法酶法分离原生质体原生质体：o 即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。o 常用的细胞壁降解酶降解酶种类有：纤维素酶、半纤维素酶、果

17、胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶胼胝质酶、EA3-867酶等。o 国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研究所产）。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o（1）优优缺缺点（与“机械法”比较）o 优点优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有植物或它们的器官、组织或细胞均可用此法获得原生质体。o 缺点缺点：是不纯的酶制剂所含杂质（如核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质）会对原生质体有不同程度的毒害作用，影响所获原生质

18、体的活力。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o顺序法顺序法（“二步法”）材料果胶酶液分离单细胞纤维素酶液去壁原生质体o 即先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，后用纤维素酶水解胞壁释放原生原生质体质体。图示如下：材料分离果胶酶液 单细胞纤维素酶液去壁原生质体 烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o（二）植物原生质体原生质体的分离程序o 以“酶

19、法一步法”为例：o 主要考虑到取材、酶的种类及纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等等。o 1、取材取材o 植物原生质体最方便和最普遍的来源是叶片。因为叶片中可以分离出大量比较均匀一致的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o 当由叶片叶片制备原生质体原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要。为了能最大程度上控制供体植株的生长条件，一些人使用了离体培养的植物，对这类片无需进行表面消毒。一些人则

20、使用温室或生长室栽种的植物，在此，一般以生长在下述条件下的植株能产生较好的结果：低光照强度（1000uW/cm2），短日照，温度2025,相对湿度6080%。o 由于从禾本科禾本科和其它一些物种的叶肉细胞分离适于培养的原生质体原生质体相当困难，因此，在这些植物中一直用培养细胞作为供体材料，频繁继代（35天1次）的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o2、酶酶的种类及纯度o 原生质体的游离，在很大程度上取决于所用酶的

21、种类及纯度。o 用来使细胞分离并降解细胞壁的酶酶制剂主要有：o（1）纤维素酶类：为从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，其作用是使细胞壁的纤维素降解，得到裸露的原生质体。o（2）果胶酶类：是从根霉和黑曲霉中提取的，可以降解中胶层，使细胞从组织中分离出来。o（3）半纤维素酶类：o常用的商品酶制剂：烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o3、酶液酶液渗透压渗透压o 离体原生质体原生质体的一个基本属性属性是它们的渗透破碎性，因而在酶溶液、原生质体清洗介质和原生质体培养基中必须加入一种

22、适当的渗透压渗透压稳定剂。o 常用的酶液酶液渗透压渗透压稳定剂有糖溶液系统和盐溶液系统两种。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o（1）糖溶液糖溶液系统：o 包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。其优点优点是分离出的原生质体原生质体能再生细胞壁，并能继续分裂。在原生质体再生完整植株的实验中，绝大多数采用糖溶液系统。o 其缺点缺点：是这几种糖糖有抑制抑制某些多糖降解酶的作用。目前，广泛使用的渗透压调节剂是山梨醇和甘露醇，浓度约在0.40.8mol/L。烧伤病人的治疗通常是取烧

23、伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节 植物原生质体培养方法o（2）盐溶液系统：o 用2.5%KCI、1%MgSO4o 特点特点：用盐盐作渗透压稳定剂，获得的原生质体可以不受植物生理状态的影响。可在不严格控制条件下栽培，而用糖系统的材料需栽培在气候箱中。盐盐系统不受材料年龄限制，甚至见到花芽的成熟植株也可采用。盐系统使某些酶有较大的活性。（为获同样去壁效果，13%甘露醇代替盐溶液，纤维素酶浓度要提高3倍。）o 因此，近些年来，多采用在盐盐溶液系统中分离原生质体，而在糖溶液系统糖溶液系统中培养原生质体。烧伤病人的治疗通常是取烧

24、伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o二、植物原生质体原生质体的纯化纯化及活力鉴定o（一）原生质体原生质体的纯化纯化o 供体组织经酶解处理后，得到一种由原生质体、细胞团和细胞碎片等组成的混合液。只有将杂质和酶液去除，使原生质体纯化，才能进行培养。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o 效果较好的提纯方法有：o1、过滤过滤离心法离心法（沉降法）：为常用方法o 利用比重原理，在

25、具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。o 优优缺缺点：优点优点：此法纯化原生质体比较简单；o 缺点缺点：由于原生质体沉积在试管底部，o 造成相互间挤压，常引起原生质体的破碎。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o2、漂浮法漂浮法：o 采用比原生质体比重大的高渗溶液，使原生质体漂浮在溶液表面。此法同样需要经过离心过滤，将大小残渣滤去。o优优缺点：优点优点：可以得到较为纯净，完整的原生质体。o 缺点缺点：由于高渗浓液对原生质体常有

26、破坏，故实o 好的原生质体数量较少。o3、不连续不连续（间断）梯度离心法梯度离心法（界面法）：o 原理原理：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中。o 优点优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免此过程中原生质体因相互挤压而破碎。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o 在原生质体培养之前，通常先对原生质体的活性进行检测。o 测定测定原生质体活性原生质体活性有多种方法，常用的有：o1、活性染料染色法活性染料染色法：常用3种：o 酚藏花红染色法：能为死

27、原生质体吸收而呈红色，活原生质体不吸收，呈无色。浓度0.01%0.02%。o 伊文思蓝染色法：亦不为活原生质体吸收而为死原生质体吸收，因此，呈蓝色。故原生质体为无活力的。浓度0.25%，1滴溶液与1滴原生质体混匀，室温下保温510，便可镜检。o荧光增白剂（CFW）染色法：o CFW可结合于新合成细胞壁的-糖苷上，在400nm激发光照射下可产生绿色荧光。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o2、胞质环流法胞质环流法：o 以具有胞质环流者为有旺盛代谢活力的指标。o3、荧光素双

28、醋酸酯荧光素双醋酸酯（FDA）染色法：（用较多）o FDA本无荧光，无极性，可自由渗透进出完整质膜，当原生质体具活力时，FDA能为原生质体的酯酶分解而成具荧光的极性物，不能再进出质膜，只累积在具活力的原生质体内，死细胞无此具荧光物质，在荧光显微镜下检查时，便解把它们分辨出来。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o4、渗透压变化法渗透压变化法：o 原生质体体积能随介质渗透压变化而改变者为活原生质体。o5、用氧电极法用氧电极法o 测定原生质体的耗氧率来估测原生质体相对活力。o

29、 上述方法各有特点。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o三、植物原生质体原生质体的培养培养o 原生质体游离纯化后，经过活力鉴定，必须在适宜的培养基上，接种一定的密度，采用适当的培养方法才能正常地生长发育，最终再生完整植株。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o（一）原生质体原生质体培养基培养基o 原生质体培养和组织培养、细胞培养一样，培养基中需要氮

30、、磷、钾、钙、镁、硫及铁等大量元素，以及锰、锌、钼、铜、钴和碘等微量元素作营养源。同时还需要糖类物质作碳源和许多有机营养。o 为了补充内源激素激素的不足，在培养基中需添加适当浓度的激素。但由于原生质体与植物细胞相比，缺乏的是细胞壁，因此，原生质体培养基的某些成分又与细胞培养的培养基略有不同。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o 主要变化变化包括去掉铵盐铵盐，降低铁和锌的浓度，提高钙的浓度，用蔗糖、核糖补充葡萄糖，添加维生素（生物素、叶酸和核黄素）、糖醇（山梨醇、甘露醇、

31、木糖和甘露糖等），有机酸（柠檬酸、苹果酸和延胡索酸等）以及成分尚不清楚的营养物质（椰子汁等）或者是变更所用的生长调节物质。o Kao和Michayluk（1975）（培养蚕豆属种的原生质体）为适应低密度培养，设计了一种复杂培养基，即KM培养基培养基，其中含有丰富的有机成分，包括维生素、氨基酸、有机酸、核苷酸、糖和糖醇以及植物生长所必需的无机营养成分。后来，这个培养基在原生质体培养中得到广泛应用。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o（二）培养物密度密度o 与细胞培养相似，

32、原生质体原生质体初始密度对植板效率有显著的影响。原生质体培养的一般密度密度是每毫升培养基1104到1105原生质体。o 在体细胞杂交和诱发突变的研究中，最好是能获得来源于单个细胞细胞的无性系无性系。为此就需要在低密度下（每毫升培养基100500个原生质体）培养原生质体或由原生质体产生的细胞。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o（三）培养方法培养方法：o 原生质体的培养方法有很多，大多数与细胞培养相同。如：琼脂培养法（1、琼脂包埋法平板法）、饲养层培养法（3、饲喂培养法）

33、、共培养法、小滴培养法以及悬滴培养法等等。o 如果按照培养基的类型类型，又可以分为三类，即：固体培养法，液体培养法及固液结合培养法。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o1、固体培养法固体培养法：（平板培养法）o 该法是指将原生质体在液体培养中形成细胞壁后再与0.6%的琼脂混合，或者在原生质体游离后，立即与琼脂的培养基混合。由于原生质体被机械地彼此分开并固定了位置，此法避免了细胞间有害代谢产物的影响，也使原生质体彼此间不会聚集成团，因而可以对各个原生质体克隆进行跟踪观察。

34、o 饲养层培养法是固体培养法的引伸。o 其培养法也是饲养层培养法的一种方式。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o2、液体培养法液体培养法：o 该法是指在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中。常用的是液体浅层培养法，即将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害较小，且便于添加培养基和转移培养物，是目前原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成局部密度过高或原生质体互相粘连而影响进一步的生

35、长和发育，并且难以定点观察单个原生质体的发育过程。o 小滴培养是液体培养的一种方式。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o3、固液结合培养法固液结合培养法：（双层培养法）o 最简便的固液结合培养法是在培养皿的底部先铺一薄层含凝胶剂的固体培养基，再在其上进行原生质体的液体浅层培养。这样，固体培养基中的营养成分可以慢慢地向液体中释放，以补充培养物对营养的需求。培养物所产生的有害物质，也可被固体部分吸收，对培养物的生长更为有利。o念珠培养法实际上是固液结合培养法的一种方式。o

36、还可以据研究材料、目的不同，在此基础上引伸和发展，创出新方法。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第三节第三节 植物原生质体培养方法o 原生质体原生质体培养程序培养程序包含：原生质体分离、原生质体纯化、原生质体培养、原生质体胞壁再生、细胞团形成和器官发生。原生质体培养程序 程 序 技 术 关 键 原生质体分离（1）机械法分离原生质体（2）酶法分离原生质体（3）影响原生质体活力的因素原生质体纯化（1）沉降法（过滤离心法）（2）漂浮法（3）界面法（不连续梯度离心法）原生质体培养（1）平板培养、浅层液体培养、双

37、层培养法（2）细胞密度104105个/ml（因种类而异）（3）培养成功的关键细胞壁再生（1）植物种类和材料的生理状态（2）培养细胞所处时期（旺盛分裂期则快）（3）与质膜稳定剂和渗透压稳定剂有关细胞分裂形成细胞团（1）基本培养基筛选（2）激素种类和浓度调节（3）渗透压调节器官形成植株再生（1）基本培养基无机盐浓度筛选（2）激素种类和浓度调节（3）渗透压调节烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o 由于植物的原生质体没有细胞壁，在人为的条件下，可以互相融合并重新产生细胞壁，而形成杂种细胞。杂种

38、细胞在以后的生长发育过程中，可以再生形成杂种植株。o 植物体细胞这种完全不经过有性过程，只通过体细胞融合创造杂种的方法，称为“体细胞杂交”。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o 植物的体细胞杂交，从Carlson（1972）建立第1株体细胞杂种植株以来，取得了令人满意的成果。短短30多年的时间里，就已经建立起一套完整的体细胞杂交体系。它能使不能通过有性过程杂交的亲本之间进行遗传物质的重组，不仅包括核基因的重组，而且也包括胞质基因的重组。与此同时，体细胞杂交技术也在不断地发展与完善，并成

39、功地用于作物改良。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o 可以预见，体细胞杂交作为作物育种的新途径，不久将为绿色革命做出巨大的贡献，特别是部分核基因转移的不对称体细胞杂种及胞质基因转移与重组的胞质杂种，在作物的改良及育种上可能具有特殊的意义。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o一、原生质体融合的方法o 原生质体的融合是植物体细胞杂交的基本技术步骤，常见的有自发融合和诱发融合。o（

40、一）自发融合o 在酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，每个同核体包含240个核。这种类型的原生质体融合叫做“自发融合”。它是由不同细胞间胞间连丝的扩展和粘连造成的。o 在由分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中，这种多核融合便更为常见。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o（二）诱发融合o 异源原生质体的融合，常常需要借助于适当的融合剂才能完成。在众多的融合中，NaNO3、高pH-高浓度钙离子及聚乙=醇效果较好。o1、NaNO3处理o 早在1909年，Kuster，19

41、72年，Carlson用此法获第一株体细胞杂种植株。o2、高pH高浓度钙离子处理：o 1973年，Keller和Melchers烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o3、聚乙二醇（PEG）处理：o 1974年，Kao和Michayluko4、电刺激法o 1979年，Mitrrgi Senda（米彻吉.森德）o5、电诱融合o 1981年，VZimmirmaa（齐默曼）和PScheurich（肖伊里兹）对“电刺激法”作了改进。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积

42、烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o二、杂种细胞的选择及鉴定o两个亲本的原生质体互相融合以后形成异核体，异核体在再生细胞壁进行有丝分裂的过程中发生核融合，称之为“杂种细胞”。o在经过融合处理后的原生质体群体内，既有未融合的2种亲本类型的原生质体，也有同核体，异核体和各种其它的核一质组合，而在多数情况下，异核体或者杂种细胞在这一混合群体中只占很小的比例。因此，如何有效地选择和鉴定杂种细胞，是体细胞杂交成败的关键。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂

43、交o（一）杂种细胞的选择o 杂种细胞的选择方法大致可分为3种：o 第一种：利用或诱发各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选出来。o 第二种：利用或人为地造成两个亲本间原生质体的物理特性差异，选出杂种细胞。o 第三种：利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异，进行选择。o 这3种方法在实际应用时，往往互相配合，具体做法需视实验材料而定。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o1、突变细胞系互补的选择方法o 突变细胞系互补选择包括叶绿素缺乏互补、营养缺陷互补、抗性互补及温度敏感

44、型互补。前两种为隐性性状，后两种为显性性状，其互补的原理是一致的。当非等位隐性基因控制的两个突变体细胞融合后，由于每一亲本细胞贡献一个功能正常的等位基因，纠正了亲本对方的缺陷，使杂种细胞表现正常。当两个抗性系的原生质体融合时，每个亲本的药物敏感性分别被亲本对方的抗性所掩盖，因而两个单抗的亲本细胞融合后产生双抗的杂种细胞，用相应的选择培养基就能将杂种细胞选出来。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o2、根据物理特性的差异选择杂种细胞o 原生质体的大小、颜色与漂浮密度等物理性状也可用作选择的

45、依据。o 由原生质体再生的愈伤组织的形态与颜色等物理性状也可用作选择的依据。o3、依据生长特性的差异进行选择o 植物细胞对培养基成分的要求与反映不同也可用作选择依据。例如，粉蓝烟草与郎氏烟草的原生质体都需要外源激素，但它们的杂种细胞可以产生内源激素，用无激素的培养基就能将杂种细胞选出来。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o（二）体细胞杂种的鉴定o 在对体细胞杂种进行选择并获得了可能的杂种再生植株以后，由于亲本细胞可能滑过选择关：另外，融合体一方的遗传物质也可能全部消失，所以必须对杂种植

46、株的真实性进行鉴定，以证明杂种细胞中存在着双亲的遗传物质。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o1、形态学鉴定o 植株的一些形态特征，如花的形状和颜色、叶片的形状和大小、花粉生活力以及表皮毛的有无等性状的表达和遗传传递，都可用来作为再生杂种植株的鉴定性状。o2、细胞学鉴定o 如果两个亲本染色体组在形态上彼此有别或是表现不同的类型，那么根尖细胞的染色体数和染色体形态便可有效地用于确定再生植株是否为杂种。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤

47、很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o3、用功酶谱分析o 同功酶是作用相似但分子结构不同的酶，它们是各种特异的基因产物，在聚丙烯酰胺或淀粉凝胶电泳中便会出现迁移率的差异。同功酶谱反映了编码这些酶的基因状态，因而可为杂种真伪提供证据。体细胞杂种可能具有双亲所有的同功酶带，也可能除双亲的谱带外还有其独特的杂种谱带。经常被用来证实体细胞杂种性质的同功酶包括有酯酶、过氧化物酶、淀粉酶、磷酸酯酶、天冬氨酸转氨酶以及丙氨酸氨肽酶等，各种同功酶的表现常因所用的植物组织和植物生长阶段而异。因此，在进行同功酶分析时，必须使用处在同一发育阶段的植物组织。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤

48、进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人第四节 体细胞杂交o4、重组DNA技术鉴定o 近来重组DNA技术已被广泛用来鉴定杂种。每个物种都有自己典型的限制性内切酶的酶切片断长度多态性的指纹图谱。用种特异的重复DNA作探讨，与DNA酶切片段杂交以后，就可以根据其特异的图谱鉴定出杂种（Saul,1984）。如果用的探讨是分布于整个基因组的高度重复的DNA序列，就可以检测出杂种中含有多少亲本的基因组成分（Zmamura，1987）。烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人植物原生质体分离原生质体纯化原生质体融合杂种植物鉴定愈伤组织形成器官化分植株再生细胞杂种的选择图：植物细胞融合程序示意图(1)双亲原生质体制备(2)采用酶法分离原生质体(3)影响原生质体活力的各种因素(1)筛网过滤(2)采用界面法化分原生质体(3)质膜稳定剂和渗透压稳定剂(1)盐融合法(2)高钙和高PH值法(3)聚乙二醇法(4)聚乙二醇和高钙、高PH值结合法(1)互补选择法:反化互补、遗传互补、营养互补(2)可见标志选择法：凹穴培养皿法、微吸管法(1)基本培养基筛选(2)激素种类和浓度调节(3)渗透压调节(1)与亲代形态特征比较(2)杂种植物核型分析(3)同工酶谱分析