病毒转基因技术原理概述课件.ppt

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1、问题问题l社会公众对健康需求的增加l生命科学和医学研究的推动l对转基因技术的安全和伦理关注持续增加。课程内容课程内容l分为理论课与实践课l转基因技术概述l病毒转基因技术原理、纯化制备技术和医学应用l生物安全l医学伦理问题l表达外源基因的复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定DNA病毒RNA病毒杂合病毒第一章第一章 转基因技术概述转基因技术概述 范雄林范雄林86-27-华中科技大学同济医学院病原生物学系华中科技大学同济医学院病原生物学系研究生高水平课程病毒转基因技术原理主要内容主要内容l基因转移方式基因转移方式l真核细胞的转基因技术真核细胞的转基因技术l外源基因表达读框的构建原理外源基因表达读框的构建

2、原理 1.定定 义义l基因转移基因转移（gene transfer）:自然发生自然发生l转基因技术转基因技术(transgene technology):(transgene technology):人工利用人工利用2.常见的基因转移方式常见的基因转移方式l转化转化(transformation)(transformation)l转导转导(transduction)(transduction)l转染转染 (transfection)(transfection)现象现象定义定义分类分类用途用途l转化转化 （transformation transformation）u现象:肺炎链球菌的转化试验肺

3、炎链球菌的转化试验u定义:u分类和应用:自然转化自然转化:感受态感受态,宿主菌种类宿主菌种类 人工转化人工转化:低温低温CaCl2CaCl2、电穿孔、电穿孔小鼠的肺炎链球菌的转化试验小鼠的肺炎链球菌的转化试验l转导转导(transduction)(transduction)u现象:“U”“U”型管实验型管实验 u定义:u分类和应用:普遍性转导普遍性转导 局限性转导局限性转导局限性转导局限性转导l转染转染 (transfection)(transfection)u现象:感染感染(infection)(infection)、病毒感染、病毒感染u定义:广义和狭义广义和狭义u分类和应用:物理化学方法物

4、理化学方法 生物学方法生物学方法(病毒载体病毒载体)野生型病毒的自然感染、病毒载体转染和质粒经化学法介导的转染野生型病毒的自然感染、病毒载体转染和质粒经化学法介导的转染3.基因转移入真核细胞的方法基因转移入真核细胞的方法l基因转移入真核细胞的影响因素基因转移入真核细胞的影响因素 l外源基因转移入真核细胞的类型外源基因转移入真核细胞的类型和方法和方法 l构建外源基因的基本要素构建外源基因的基本要素 转移入原核细胞的影响因素:u限制限制-修饰系统修饰系统u质粒宿主范围和相容性质粒宿主范围和相容性u同源重组与非同源重组同源重组与非同源重组l基因转移入真核细胞的影响因素基因转移入真核细胞的影响因素 真

5、核与原核细胞具有显著区别;外源基因要进入真核细胞，要突破三大障碍;理想的转基因技术方法质粒型载体:l物理方法l化学方法l外源基因转移入真核细胞的类型和方法外源基因转移入真核细胞的类型和方法l传统的针头注射l显微注射l粒子轰击l电穿孔l流体动力学l包裹微球l超声l磷酸钙法l脂质体法lDEAE-Dxtran法常用的物理方法介常用的物理方法介导基因基因转移移物理方法原理材料DNA用量优点缺点传统的针头注射外力注射器高便宜、简单、便于应用于临床效率比较低显微注射细胞内注射DNA显微镜和显微注射针低适用于细胞水平的研究，不易降解步骤繁琐，不适用于临床，专业技术要求高粒子轰击高压气体使微小的载体加速不同的

6、加速装置低对靶组织有很高的效率需要很多的设备和步骤电穿孔电脉冲电穿孔仪低高转染效率未得到广泛认可流体动力学流体动力学的力量特殊的注射器中等简单易于使用、转染效率高组织局限性包裹微球胶囊化的微球包裹DNA中等控制下投递和释放制备的质量控制超声超声仪超声超声仪中等偏低安全、组织损伤小技术不断发展、经验有限l外源基因转移入真核细胞的类型和方法外源基因转移入真核细胞的类型和方法病毒颗粒型载体(病毒介导的转基因技术)u假型病毒载体（复制缺陷性病毒载体）：具有感染性u重组型病毒载体：具有感染性lDNA病毒载体：AdV,AAV,HSV-1,etc.lRNA病毒载体:HIV,etc.l杂合型病毒载体 分类分类

7、DNA病毒载体病毒载体RNA病毒载体病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体痘苗病毒载体杆状病毒载体鼠白血病病毒载体慢病毒载体甲病毒载体仙台病毒载体优点优点外源基因容量大(6-36kb);不整合到宿主染色体中，安全性高；宿主范围广泛，可感染包括分裂期和静止期细胞在内的不同类型的人和多种哺乳动物细胞；易于制备和纯化,病毒滴度高达 109 pfu/ml外源基因可整合到人细胞基因组中实现长期稳定表达；可感染包括非分裂期细胞在内的多种细胞；载体的免疫原性和毒性低，无致病性，安全性好；病毒滴度高达10 10pfuml，易于制备和纯化载体容量大(30kb 50kb),并可同时表达多基因；不能整合到

8、细胞基因组中；宿主范围广，包括大量哺乳动物和鸟类的分裂细胞和非分裂细胞，对神经系统有天然的亲嗜性，并能在神经元细胞中建立长期稳定的隐性感染载体容量大（25kb40kb），并可同时表达多基因；宿主范围广，能感染几乎所有哺乳动物细胞；不会整合到宿主细胞基因组中，安全性好载体容量大(38 kb)，并可同时表达多基因；只能感染昆虫宿主，在人体细胞内不能复制，生物安全性高且无细胞毒性；外源蛋白的表达水平高达到细胞总蛋白的50插入外源基因的容量相对较大(10kb)；能够有效整合到靶细胞的基因组中；感染细胞种类广泛，效率高；病毒滴度较高(106-107pfuml)可将外源基因有效地整合人宿主细胞染色体上；长

9、期稳定的表达；可有效地感染受精卵、神经元细胞、干细胞等多种类型的细胞；对分裂期和非分裂期细胞均能感染；不易诱发宿主免疫反应不易与宿主基因组整合；宿主范围广谱，感染哺乳动物及非哺乳动物的细胞系、原代细胞培养物、嗜神经元特性；机体对甲病毒载体自身的免疫反应较低不会与宿主DNA发生整合，安全性高；宿主细胞广；可在多种细胞内获得较强的基因表达缺点缺点潜在产生复制能力的腺病毒；缺乏靶向性；基因表达时间短；宿主对载体的免疫反应较强载体的容量相对较小(4.5kb)；与宿主染色的整合是一种随机整合仅能瞬时表达；细胞毒性免疫反应弱；病毒用量大；制备病毒的滴度低表达产物的纯化困难随机性的整合会造成表达的不确定性和

10、潜在致瘤危险性潜在的生物安全性和遗传毒性转染效率比较低、甲病毒RNA载体的稳定性差、细胞毒性、仅能在体内瞬时表达包装容量小(3.4kb)；细胞融合毒性；宿主对载体的免疫反应较强不同不同类型型转基因技基因技术方法的方法的优缺点比缺点比较转基因技术方法 优点缺点生物学方法（病毒载体介导法）转染效率高复杂的生产程序适合全身应用 产品的高质量控制具有靶向组织细胞能力高成本机体预存在的免疫力可以干扰载体低温保存安全问题化学方法易转染培养细胞难以生产稳定产品生产简单临床应用少易保存基因大小不受限物理方法基因大小不受限需要特殊设备常ex vivo应用，局部应用高效非特定细胞型操作程序易标准化l构建外源基因的基本要素构建外源基因的基本要素 u转录控制元件u翻译控制元件u病毒复制包装信号 复习思考题复习思考题l影响外源基因进入真核细胞的因素。l物理、化学和病毒载体转基因技术的优缺点比较。l不同病毒载体转基因技术的优缺点比较。l外源基因表达读框的构建原理。