免疫学检测技术-课件.ppt

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1、免疫学检测技术免疫学检测技术一、一、免疫学检验原理免疫学检验原理抗原抗原-抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度高度特异性结合特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在于反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（血清中，故又称血清学反应（serological serological reaction)reaction)应用：应用：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原：用已知抗体检测未知抗原：定性或定量检测体内各种分子；定性或定量检测体内各种分子；用已知抗体检测半抗原物质。用已知抗体检测半抗原物质。1.1

2、.特异性和交叉反应特异性和交叉反应特特异异性性：一一种种抗抗原原通通常常仅仅能能与与由它刺激所产生的抗体结合。由它刺激所产生的抗体结合。分分子子基基础础：抗抗原原表表位位与与抗抗体体分分子高变区之间空间构型的互补性子高变区之间空间构型的互补性。（一）抗原（一）抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点交交叉叉反反应应（cross cross reactionreaction）性性：若若两两种种抗抗原原分分子子有有一一个个或或数数个个相相同同（或或相相似似）的的决决定定基基，则则针针对对一一种种抗抗原原的的抗抗血血清清可可与与另另一一种种抗抗原原发发生生反应。反应。结合价：结合价：天天然然抗抗原原分分子

3、子表表面面一一般般含含多多种种抗抗原原决决定定基基，可可与与多多个个抗抗体体分分子子结结合合，为为多多价价。单单体体形形式式的的抗抗体体分分子子有有两两个个FabFab段段，能能结结合合两两个个相相同同的的抗抗原原决决定定基基，为为两价两价。2.2.比例性比例性比例合适：比例合适：若若抗抗原原、抗抗体体的的数数量量比比例例合合适适，抗抗体体分分子子的的两两个个FabFab段段分分别别与与两两个个抗抗原原决决定定基基结结合合，相相互互交交叉叉连连接接成成网网格格状状复复合合体体，则则反反应应体体系系中中基基本本不不存存在在游游离离的的抗抗原原或或抗抗体体，此此时时形形成肉眼可见的反应物（沉淀物或

4、凝集物）。成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。前带现象（前带现象（prozone）和后带现象）和后带现象(postzone)v Ab过剩和过剩和Ag过剩过剩抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，与两者的浓度和比例密切相关与两者的浓度和比例密切相关与两者的浓度和比例密切相关与两者的浓度和比例密切相关前带现象（前带现象（prozoneprozone）和后带现象）和后带现象(postzo

5、ne)(postzone)AbAb过剩和过剩和AgAg过剩过剩网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗体过剩抗原过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗体抗体比例合适抗原抗原抗体抗体 抗抗原原-抗抗体体反反应应为为分分子子表表面面的的非非共共价价结结合合，结结合合虽虽稳稳定定但但可可逆逆。在在一一定定条条件件下下（如如低低pHpH、高高浓浓度度盐盐、冻冻融融等等），抗抗原原-抗抗体体复复合合物物可可被被解解离离。解解离离后后的的抗抗原原和和抗抗体体仍仍保保持持原原有有理理化化特特性性和和生生物物学活性。学活性。根根据据此此特特点点，可可借借助助亲亲和和层层析析法法纯纯化化抗抗原原或或抗

6、抗体。体。3.3.可逆性可逆性4.4.阶段性阶段性抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段：特异性结合阶段：反应快，不可见。反应快，不可见。反应快，不可见。反应快，不可见。可见的反应阶段：可见的反应阶段：反应慢，出现凝集、沉淀和反应慢，出现凝集、沉淀和反应慢，出现凝集、沉淀和反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。细胞溶解等现象。细胞溶解等现象。细胞溶解等现象。1.1.电解质电解质抗抗原原和和抗抗体体有有对对应应的的极极性性基基团团，能能相相互互吸吸附附并并由由亲亲水水性性变变为为疏疏水水性性。电电解解质质的的存存

7、在在使使抗抗原原-抗抗体体复复合合物物失失去去电电荷荷而而凝凝聚聚，出出现现可可见见反反应应，故故免疫学试验中免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体多用生理盐水稀释抗原或抗体。（二）、抗原（二）、抗原-抗体反应的影响因素抗体反应的影响因素2.2.酸碱度酸碱度 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pHpH是是6-86-8。3.3.温度温度最最适适温温度度为为3737。有有些些例例外外，如如冷冷凝凝集集素素在在 44左左右右与与红红细细胞胞结结合合最最好好，2020以以上上反反而而解解离。离。4.4.抗原和抗体的性质抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗

8、体抗体反应的关键因素。反应的关键因素。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原种类等均可影响抗原-抗体反应。抗体反应。抗体分子上一个抗抗体分子上一个抗原结合点与对应的原结合点与对应的抗原决定基之间的抗原决定基之间的结合能力结合能力亲和力亲和力(affinity)根根据据抗抗原原的的性性质质、结结合合反反应应的的现现象象、参参与与反反应的成分等因素分类：应的成分等因素分类：1.凝集反应凝集反应2.沉淀反应沉淀反应3.补体参加的反应补体参加的反应4.免疫标记技术免疫标记技术（三）、免疫学检验方法（三）、免疫学检验方法反应类型反应类型实验技术实验技术

9、非非标标记记凝集反应凝集反应直接凝集试验、间接凝集试验、间接直接凝集试验、间接凝集试验、间接抑制凝集试验、协同凝集试验抑制凝集试验、协同凝集试验沉淀反应沉淀反应液相内凝集试验、凝胶内凝集试验液相内凝集试验、凝胶内凝集试验补体参与的反应补体参与的反应补体溶血试验、补体结合试验补体溶血试验、补体结合试验中和反应中和反应病毒中和试验、毒素中和试验病毒中和试验、毒素中和试验标标记记标记免疫反应标记免疫反应荧光免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术发光免疫技术发光免疫技术金免疫技术金免疫技术 颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在

10、一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应反应(agglutination)(agglutination)。用于凝集反应中的抗原称用于凝集反应中的抗原称凝集原凝集原(agglutinogen)(agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称用于凝集反应中的抗体称凝集素（凝集素（agglutinin)agglutinin)。凝集反应（凝集反应（Agglutination TestsAgglutination Tests）1 1 1 1直接凝集（直接凝集（directagglutination)：细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或细菌或

11、红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。红细胞凝集现象。2 2间接凝集间接凝集（indirectorpassiveagglutination)：检测针检测针 对可溶性对可溶性AgAg的的AbAb3 3间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验(directagglutinationinhibitiontest)4.4.协同凝集试验协同凝集试验（co-agglutinationtest）载体为金葡菌，其细胞壁蛋白载体为金葡菌，其细胞壁蛋白A A与与IgG IgG 的的FcFc结合，用结合，用于细菌、病毒的快速检测。于细菌、病毒的快速检测。妊娠免疫诊断试验妊娠免疫诊断试验 v孕妇尿中，绒毛膜促

12、性腺激素（孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）含量明显增高。）含量明显增高。（HCGHCG是可溶性抗原是可溶性抗原 ）v反之，非孕妇尿中反之，非孕妇尿中HCGHCG含量甚微，不足以消耗掉抗含量甚微，不足以消耗掉抗HCGHCG抗体。抗体。HCGHCG检测为间接凝集试验的应用检测为间接凝集试验的应用Definition:Definition:可可溶溶性性抗抗原原（血血清清蛋蛋白白、外外毒毒素素、细细菌菌滤滤液液等等）与与相相应应抗抗体体结结合合，在在一一定定条条件件下下，形形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。沉淀反应（沉淀反应（Precipi

13、tationTests）用于沉淀反应中的抗原称用于沉淀反应中的抗原称沉淀原沉淀原(precipitonogen)(precipitonogen)。用于沉淀反应中的抗体称用于沉淀反应中的抗体称沉淀素沉淀素（precipitin)precipitin)。v大多沉淀反应大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质多用半固体琼脂凝胶作为介质进行进行琼脂扩散琼脂扩散或或免疫扩散免疫扩散，即可溶性抗原与，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。成可见的白色沉淀。1 1单向免疫扩散单向免疫扩散(single immunodiffusion)(si

14、ngle immunodiffusion)2 2双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion)(double immunodiffusion)沉淀反应沉淀反应单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)(Single Immunodiffusion)v是将一定量已知抗体混于琼是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的抗原孔为中心的沉淀环沉淀环，环，环的直径

15、与抗原含量成正比相的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清关。本法常用于测定血清IgGIgG、IgMIgM、IgA IgA 和和 C C 3 3等的等的含量。含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环双向免疫扩散双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)Double Immunodiffusion)v是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成在比例合适处形成沉淀线沉淀线。如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小上的抗原抗体系统，则小孔间可

16、出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或抗体的定性抗体的定性 、组成和两种、组成和两种抗原相关性分析的检测。抗原相关性分析的检测。补体结合试验补体结合试验（Complement Fixation test,CFT)Complement Fixation test,CFT)敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。现在已有被其它新方法取代的趋势。现在已有被其它新方法取代的趋势。现在已有被其它

17、新方法取代的趋势。补体结合试验补体结合试验(complementfixationtest，CFT)将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应系统中抗原或抗体的传统方法。系统中抗原或抗体的传统方法。试验原理试验原理作用原理：作用原理：利用补体的溶细胞作用进行各种利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定物理状态的抗原抗体测定5种成分，种成分，3个系统个系统反应系统（溶菌系统）：反应系统（溶菌系统）：已知已知抗原抗原（或抗体）（或抗体）与待测与待测抗体抗体（或抗原）（或抗原）补体补体系统：系统：指示系统（溶血系统）：指示系统（溶血系统）：SRBC与相应

18、与相应溶血素溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitizedsheepredbloodcell,SRBCS）。溶溶菌菌系系统统反应分两步进行反应分两步进行 第一步第一步:反应系统与补体的作用反应系统与补体的作用 第二步第二步:指示系统利用剩余补体的反应指示系统利用剩余补体的反应不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性已知抗原加入血清（检测抗体）已知抗原加入血清（检测抗体）加入标准量补体加入标准量补体加入包被抗体的红细胞加入包被抗体的红细胞检测红细胞溶解情况检测红细胞溶解情况AgPatien

19、tsserum AbNo AbAg 用用荧荧光光素素、酶酶、放放射射性性核核素素或或化化学学发发光光物物质质等等标标记记抗抗体体或或抗抗原原，进进行行抗抗原原-抗抗体体反反应应的的检检测测，是是目目前前应应用用最最为为广广泛泛的的免免疫疫学学检检测测技技术术。标标记记物物与与抗抗体体或或抗抗原原连连接接后后并并不不改改变变抗抗原原抗抗体体的的免免疫疫特特性性，具具有有灵灵敏敏度度高高、快快速速、可可定定性性、定定量量、定定位位等等优优点。点。免疫标记技术免疫标记技术（Immunolabelling techniqueImmunolabelling technique）用用荧荧光光素素与与抗抗体

20、体连连接接成成荧荧光光抗抗体体，再再与与待待检检标标本本中中抗抗原原反反应应，置置荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察，抗抗原原-抗抗体体复复合合物物散散发发荧荧光光，借借此此对对抗抗原原进进行行定定性或定位。性或定位。1免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence,IF)（1 1）直接荧光法：）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本进荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。抗原均须制备相应荧光抗体。（2 2）间接荧光法：）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用用一抗与标本中抗原结合，

21、再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测于多种抗原的检测,但非特异性反应亦增强。但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法分类免疫荧光法图示免疫荧光法图示此此法法将将抗抗原原-抗抗体体反反应应的的特特异异性性与与酶酶催催化化作作用用的的高高效效性性相相结结合合，借借助助酶酶作作用用于于底底物物的的显显色色反反应应判判定定结结果果。应应用用酶酶标标测测定定仪仪测测定定光光密密度度（ODOD）值值可反映抗原含量，灵敏度达可反映抗原含量，灵敏度达ng

22、/mlng/ml甚至甚至pg/mlpg/ml水平。水平。常常见见的的标标记记物物为为：辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（HRPHRP）和和碱碱性磷酸酶（性磷酸酶（APAP）酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)常用的方法如下：常用的方法如下：（1 1）酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验 (enzyme linked (enzyme linked immunosorbent assayimmunosorbent assay，ELISA)ELISA)1 1 1 1）ELISAELISAELISAELISA是酶免疫测定中应用最广的技术，用于是酶免疫测定中应用最广的技术，用于

23、测定测定可溶性抗原或抗体。可溶性抗原或抗体。优点：灵优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。成分、细胞因子等。分类：（1 1）放射免疫分析法）放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)(radioimmunoassay,RIA)（2 2）免疫放射分析法（）免疫放射分析法（immunoradiometric assay,immunoradiometric assay,IRMA IRMA

24、）3放射免疫技术放射免疫技术 乃乃用用放放射射性性核核素素标标记记抗抗原原或或抗抗体体进进行行免免疫疫学学检检测测。该该法法兼兼有有放放射射性性核核素素的的高高灵灵敏敏度度和和抗抗原原-抗抗体体反反应应的的特特异异性性，检检测测灵灵敏敏度度达达pgpg水水平平。常常用用于于标标记记的的放放射射性性核核素素为为125125I I和和131131I I，分分为为液液相相和和固固相两种方法。相两种方法。该该法法常常用用于于测测定定微微量量物物质质，如如胰胰岛岛素素、生生长长激激素素、甲甲状状腺腺素素、孕孕酮酮等等激激素素，吗吗啡啡、地地高高辛辛、IgEIgE等。等。放射免疫分析法放射免疫分析法(ra

25、dioimmunoassay,RIA)属于非竞争性放射性配体结合分析技术。他与属于非竞争性放射性配体结合分析技术。他与RIARIA为代表的竞争性放射性配体分析技术的区别主要为代表的竞争性放射性配体分析技术的区别主要有两点：一，放射性核素标记的是抗体而不是抗原，有两点：一，放射性核素标记的是抗体而不是抗原，其二是采用过量抗体而不是限量抗体。其二是采用过量抗体而不是限量抗体。RIMARIMA与与RIARIA相相比较，提高了检测的灵敏度并使检测范围增宽，特比较，提高了检测的灵敏度并使检测范围增宽，特异性和精确度进一步提高。异性和精确度进一步提高。免疫放射分析法免疫放射分析法（immunoradiom

26、etric assay,IRMAimmunoradiometric assay,IRMA）免疫放射分析法有以下特点：免疫放射分析法有以下特点：1.1.以标记抗体作为示踪剂以标记抗体作为示踪剂2.2.反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性反应动力学：因标记抗体是过量的，且反应是非竞争性 的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比的，抗原抗体是全量反应，故反应速度比RIARIA快。快。3.3.灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的灵敏度明显高于放射免疫分析，约为放射免疫分析的1010100100倍。倍。4.4.标准曲线工作范围宽。标准曲线工作范围宽。5.5.特异性高。特异性高。6.6.

27、稳定性好。稳定性好。金标记免疫技术金标记免疫技术 胶体金标记技术胶体金标记技术 (Immunogold labeling(Immunogold labeling technique)technique)是以胶体金作为示踪标记物，应是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。免疫胶乳试验应用免疫胶乳试验应用胶乳凝集试验胶乳凝集试验原理：原理：胶乳凝集试验是一种间接凝集试验，它是以聚胶乳凝集试验是一种间接凝集试验，它是以聚苯乙烯胶乳微粒作为惰性载体。胶乳为人工合成的苯乙烯胶乳微粒作为惰性载体。胶乳为人工合成的载体，因此其性能比生物来源

28、的红细胞稳定，均一载体，因此其性能比生物来源的红细胞稳定，均一性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不性好。但胶乳与蛋白质的结合能力以及凝集性能不如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏如红细胞，因此作为间接凝集试验，胶乳试验的敏感度不及血凝试验。感度不及血凝试验。胶乳凝集试验胶乳凝集试验方法：v传统的胶乳凝集试验分试管法与玻片法。v试管法先将受检标本在试管中以缓冲液作倍比稀释，然后加入致敏的胶乳试剂，反应后观察胶乳凝集结果。v玻片法操作简便，1滴受检标本和1滴致敏的胶乳试剂在玻片上混匀后，连续摇动23min即可观察结果。出现大颗粒凝集的为阳性反应，保持均匀乳液状为阴性反应。抗链球菌溶

29、血素抗链球菌溶血素“O”（ASO）原理：原理：胶乳凝集试验原理相同，在受检者血胶乳凝集试验原理相同，在受检者血清中，加入溶血素清中，加入溶血素“O O”,出现凝集颗粒，出现凝集颗粒，即为阳性。即为阳性。参考值：参考值：ASO250U/LASO250U/L临床意义：临床意义：1.ASO1.ASO测定对于诊断测定对于诊断A A族链球菌感染很有价值，其存在族链球菌感染很有价值，其存在及含量可反映感染的严重程度。及含量可反映感染的严重程度。2.2.风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、风湿热、急性肾小球肾炎、结节性红斑、猩红热、急性扁桃体炎等急性扁桃体炎等ASOASO明显升高。明显升高。3.3.

30、少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病少数肝炎、结缔组织病、结核病及多发性骨髓瘤病人亦可使人亦可使ASOASO增高。增高。4.4.当效价当效价250U/L250U/L时，才被认为有诊断价值。时，才被认为有诊断价值。抗链球菌溶血素抗链球菌溶血素“O”（ASO）类风湿因子（类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（RA）是由自身抗体免是由自身抗体免疫复合物引起的自身免疫性疾病。疫复合物引起的自身免疫性疾病。类风湿因子是由于感染因子（细菌、病类风湿因子是由于感染因子（细菌、病毒等）引起体内产生的以变性毒等）引起体内产生的以变性IgG为抗原的一为抗原的一

31、种抗体，故又称抗抗体。种抗体，故又称抗抗体。原理：原理：将变性将变性IgGIgG包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致包被于聚苯乙烯胶乳颗粒上，这种致敏胶乳在与待测血清中的敏胶乳在与待测血清中的RFRF相遇时，即发生肉眼可相遇时，即发生肉眼可见的凝集。见的凝集。参考值：参考值：正常人正常人1 1：2020稀释血清为阴性。稀释血清为阴性。类风湿因子（类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）临床意义：临床意义：1.1.约约90%90%类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（RARA）患者的）患者的RFRF呈阳性。呈阳性。2.2.某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进

32、行性全身性硬化症、干燥综合征、全身性硬化症、干燥综合征、SLESLE等。等。3.3.一些其他疾病如血管炎、一些其他疾病如血管炎、肝病肝病、慢性感染也、慢性感染也可出现可出现RFRF。类风湿因子（类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：原理：v使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。免疫活性。v使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。活性。v结合在固相

33、载体上的酶量与标本中受检物质的量成结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关接相关 。ELISA主要有以下几种类型：主要有以下几种类型：1.1.双抗体夹心法测抗原（常用）双抗体夹心法测抗原（常用）2.2.双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体3.3.间接法测抗体（常用）间接法测抗体（常用）4.4.竞争法测抗原竞争法测抗原5.5.竞争法测抗体竞争法测抗体6.6.捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体7.7.亲和素亲和素-生

34、物素生物素 ELISAELISA法法包被特异性抗体包被特异性抗体加入待测样品加入待测样品加酶标特异性抗体加酶标特异性抗体底物显色底物显色洗涤孵育洗涤孵育双抗体夹心法测抗原v待测抗原须有两个可以与抗体结合的部位，其一端与包被于固相载体上的抗体结合，另一端与酶标记的特异性抗体结合。v此法适用于检验各种二价或二价以上的大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。不能用于分子量小于5000的半抗原或小分子单价抗原的测定。双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体v反应模式与双抗体夹心法类似。v用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。v此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定。v乙肝标

35、志物中HBsAb的检测常采用本法。关键在于根据抗原结构的不同制备酶标抗原。间接法测抗体间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法。原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。操作步骤：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相 抗原，洗涤。（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固 相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。间接法的特点间接法的特点v本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。病

36、的诊断。v间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。一酶标抗体检测相应抗体。v间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。响包被效果。竞争法测抗原竞争法测抗原操作步骤操作步骤：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体洗涤。体洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的）待测管中加受检

37、标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗混合溶液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标最多，故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管本中抗原含量越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。竞争法测抗体竞争法测抗体v当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异

38、性抗体。体。v标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。反应。捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体v样品中针对某些抗原的特异性样品中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性常和特异性IgG同时存在，后者会干扰同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。抗体的测定。因此测定因此测定IgM抗本多用捕获法。抗本多用捕获法。v先将所有样品先将所有样品IgM（包括特异性（包括特异性IgM和非特异和非特异性性IgM）固

39、定在固相上，在去除）固定在固相上，在去除IgG后再测定后再测定特异性特异性IgM。操作步骤：（1）将抗）将抗IgM抗体抗体连接连接在固相载体上，形成固相抗在固相载体上，形成固相抗IgM，洗涤。，洗涤。（2）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的）加入稀释的待测标本：孵育后样品中的IgM抗体被、抗体被、固相抗体捕获，洗涤。固相抗体捕获，洗涤。（3）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性）加入特异性抗原试剂：其仅与固相上的特异性IgM结合，洗涤。结合，洗涤。（4）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上）加入针对抗原的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合，洗涤。的抗原反应结合，洗涤。（5）加

40、底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在、）加底物显色：如有颜色显示，则表示标本中存在、特异性特异性IgM抗体，是为阳性反应抗体，是为阳性反应。亲和素亲和素-生物素生物素-ELISA法法v亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。v生物素（biotin）又称维生素H，存在于蛋黄中。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。v亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，形成一种极为稳定的复合体。v把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。乙型肝炎血清学检验临床意义乙型肝炎血清学检验临床意

41、义 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（HBVHBV）引）引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。化为肝硬化或肝癌。传播途径：传播途径：血液传播、性接触传播和母婴传播血液传播、性接触传播和母婴传播vHBV的抗原有的抗原有3种：表面抗原（种：表面抗原（HBsAg）、核心抗）、核心抗原（原（HBcAg）和）和e抗原（抗原（HBeAg）。表面抗原大量）。表面抗原大量存在于感染

42、者血液中，是存在于感染者血液中，是HBV感染以及检测的主要感染以及检测的主要标志。标志。v核心抗原是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋白。由核心抗原是乙肝病毒核心颗粒的唯一结构蛋白。由于它存在于于它存在于Dane颗粒核心结构表面，被表面抗原覆颗粒核心结构表面，被表面抗原覆盖，故不易在血循环中检出。可刺激机体产生抗盖，故不易在血循环中检出。可刺激机体产生抗-HBc。ve抗原为可溶性蛋白质，在病理上认为是抗原为可溶性蛋白质，在病理上认为是HBV复制复制以具有强感染性的一个指标。抗以具有强感染性的一个指标。抗-HBe的出现，是预的出现，是预后良好的征象。后良好的征象。HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗H

43、Be抗抗-HBc临床意义临床意义过去和现在均未感染过去和现在均未感染HBV曾感染曾感染HBV，急性感染恢复，急性感染恢复期期过去和现在均已感染过过去和现在均已感染过HBV预防注射疫苗预防注射疫苗既往感染；急性既往感染；急性HBV感染恢感染恢复期复期既往感染；急性既往感染；急性HBV感染已感染已恢复恢复急性急性HBV感染；慢性感染；慢性HBsAg携带者携带者HBsAg抗抗-HBsHBeAg抗抗HBe抗抗-HBc临床意义临床意义急性急性HBV感染趋向恢复；慢性感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者携带者，传染性弱；，传染性弱；长期持续易长期持续易癌变癌变急性或急性或慢性乙肝慢性乙肝，传染性极强，传染性

44、极强急性急性HBV感染早期，感染早期，HBsAg携带者携带者急性急性HBV感染早期，传染性强感染早期，传染性强急性感染中期急性感染中期急性感染趋向恢复；慢性急性感染趋向恢复；慢性携带携带者者急性感染趋向恢复急性感染趋向恢复急性感染趋向恢复急性感染趋向恢复艾滋病实验室检验艾滋病实验室检验 艾滋病是一种危害性极大的传染病，由艾滋病是一种危害性极大的传染病，由感染艾滋病病毒（感染艾滋病病毒（HIVHIV病毒）引起。病毒）引起。HIVHIV是一是一种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免种能攻击人体免疫系统的病毒。它把人体免疫系统中最重要的疫系统中最重要的T T淋巴细胞作为主要攻击目淋巴细胞作为主要攻击

45、目标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，标，大量破坏该细胞，使人体丧失免疫功能，HIVHIV在人体内的潜伏期平均为在人体内的潜伏期平均为8 89 9年年 。艾滋病从感染到发病的一般过程艾滋病从感染到发病的一般过程感染分期感染分期临床分期临床分期维持时间维持时间感染标志物感染标志物传染性传染性原发感染原发感染潜伏期潜伏期潜伏期潜伏期2-42-4周周 抗体阴性抗体阴性(窗口期窗口期)传染传染危险性高危险性高原发感染原发感染症状期症状期急性急性HIV感染感染1-21-2周周 传染传染危险性高危险性高慢性感染慢性感染潜伏期潜伏期无症状无症状HIV感染感染2 21515年年(平均平均 8-10 8-1

46、0 年年)抗体阳性抗体阳性有传染性有传染性临床临床发病期发病期艾滋病艾滋病0 03 3年年(平均平均 1-21-2 年年)抗体阳性抗体阳性抗原阳性抗原阳性传染性强传染性强艾滋病检测的方法艾滋病检测的方法检验标志物检验标志物检验目的检验目的检检 验验 方方 法法HIV(1+2)HIV(1+2)抗体抗体筛查试验筛查试验金标法、硒标法金标法、硒标法 快速诊断试验快速诊断试验明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验(PA)(PA)微孔板法微孔板法酶联免疫试验酶联免疫试验（ELISAELISA）第三代：双抗原夹心法第三代：双抗原夹心法 第四代：增加检测第四代：增加检测P24P24抗原抗原确证试验确证试验免疫印迹

47、法免疫印迹法(WB)(WB)手工手工/仪器仪器HIV抗体筛查试验抗体筛查试验明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验的操作和结果判断的操作和结果判断5 5 450/630nm450/630nm下测定下测定ODOD值值混匀，加盖，混匀，加盖，3737温育温育 洗板洗板3 3 加入底物加入底物第二次特异性结合第二次特异性结合4 4 加入终止液加入终止液1 1 加入样品加入样品 洗板洗板2 2 加入酶标记物加入酶标记物 加盖，加盖，3737温育温育加盖，加盖，3737温育温育第一次特异性结合第一次特异性结合酶联免疫分析酶联免疫分析 ELISAELISA（双抗原夹心、两步法）（双抗原夹心、两步法）HIV抗体检

48、测结果处理规范抗体检测结果处理规范检测方法检测方法检测结果检测结果检验报告检验报告处理处理筛查试验筛查试验阴性阴性HIVHIV抗体阴性抗体阴性阴性告知阴性告知阳性阳性HIVHIV抗体待复查抗体待复查上送确证上送确证确证试验确证试验阴性阴性HIVHIV抗体阴性（抗体阴性（-）阴性告知阴性告知阳性阳性HIVHIV抗体阳性（抗体阳性（+）阳性告知，个案调查阳性告知，个案调查不确定不确定HIVHIV抗体不确定（抗体不确定（）告知，告知，3 3个月后复查共个月后复查共2 2次次样品初筛检测初筛检测阳性反应阴性反应筛查试剂复查复查原有试剂加另一种筛选试剂均阳性反应一阴一阳均阴性反应送确认实验室确认报告阴性

49、HIV抗体确证试验抗体确证试验WesternBlot免疫印迹法免疫印迹法 针对各种病毒蛋白的特异抗体针对各种病毒蛋白的特异抗体针对各种病毒蛋白的特异抗体针对各种病毒蛋白的特异抗体 区分区分区分区分ELISAELISAELISAELISA真阳性与假阳性真阳性与假阳性真阳性与假阳性真阳性与假阳性 检测检测检测检测HIV-1HIV-1HIV-1HIV-1和和和和HIV-2HIV-2HIV-2HIV-2全自动免疫印迹仪全自动免疫印迹仪肿瘤标志物检测的临床应用肿瘤标志物检测的临床应用肿瘤标志物的定义肿瘤标志物的定义肿瘤标志物肿瘤标志物（tumormarker，TM）是是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤

50、细胞指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，而产生的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺等。包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺等。可在肿瘤患者血液或体液中检测到肿瘤标志可在肿瘤患者血液或体液中检测到肿瘤标志物。物。肿瘤标志物的分类肿瘤标志物的分类癌胚抗原类标志物癌胚抗原类标志物糖类抗原标记物糖类抗原标记物酶类标志物酶类标志物激素类标志物激素类标志物蛋白类标志物蛋白类标志物胚胎抗原类标志物胚胎抗原类标志物1 1、甲胎蛋白、甲胎蛋白AFPAFP 胎儿发