培养基制备与灭菌.ppt

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1、培养基的制备与灭菌培养基的制备与灭菌一、目的与要求：1、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。2、学习高压蒸汽灭菌操作技术。3、了解干热灭菌操作要点。二、原理及说明:培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。一般来说，培养基包括有水份、碳源、氮源、无机盐类以及生长因素等五大类营养成份。此外还得有适宜的PH值，一定的渗透压（即浓度）以及氧化还原电位等。1、培养基的分类（1）根据培养基原料来源不同：天然培养基、合成培养基、半合成培养基（2）根据物理性状分为：液体培养基、固体培养基、半固体培养基（3）根据培养目的不同：鉴别培养基、分离培养基、选择培养基2、培

2、养基的配制（1）称药：）称药：按下列培养基的配方准确称取各成分，其中牛肉膏放在小烧杯里称量，其他成分放在称量纸上称量。阿斯毕无氮培养基：甘露醇（或蔗糖、葡萄糖）10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g琼脂 20g水 1000mlPH 自然 121oC 灭菌30分钟（2）溶化：）溶化：用烧杯先装少许水,依次将药品倒入铝锅中，加足水，然后在电炉上加热溶化。（3）PH值：值：用精密的PH试纸测定，并用1%氧化钠或5%盐酸调节到所需的PH值。（4）过滤：）过滤：趁热用纱布将培养基进行过滤。（5）分装：）分装：过滤后根据不

3、同需要，立即趁热装入试管或三角瓶等容器中，分装如图：注意事项：（1）不要使培养基沾在管口，如沾上，需用干净的纱布擦干净。（2）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜。（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/61/5灭菌后制成斜面。分装三角瓶容量之一半为宜。（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。（6）做棉塞装好培养基的试管都要加上棉塞，这样既可过滤空气，避免杂菌侵入，又可减缓培养基水分的蒸发，制棉塞的方法多种，形状各异，总原则如下：（1）用脱脂棉制作（脱脂棉花易吸水）（2）松紧适合（3）塞头不要太大，一般为球状。（7）包装试管口或三角

4、瓶口棉塞部分，用牛皮纸扎，以防灭菌时水蒸气打湿棉塞。（8）灭菌）灭菌灭菌是指杀死物品上或环境中的所有微生物。灭菌方法可分为四种：物理灭菌、机械灭菌、化学灭菌和生物灭菌。物理灭菌：1、热力灭菌：2、紫外光灭菌：一般应用于无菌室和接种箱的灭菌。热力灭菌热力灭菌：干热灭菌：适用于玻璃仪器，将物品放入烘箱，160170oC，12小时。火焰灭菌：适用于常用用具，如接种环、镊子等。灭菌方法是放在火焰上直接灼烧。湿热灭菌：(1)高压蒸汽灭菌：适用于培养基、衣物等的灭菌。（2）间歇蒸汽灭菌：适用于不耐高温的培养基或无高压蒸汽灭菌锅时。（3）巴斯德灭菌：适用于牛乳类等不耐高温的物体。紫外光灭菌：一般应用于无菌室

5、和接种箱的灭菌。原理与区别原理与区别基本原理基本原理：即通过不同的加热方法，使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌的目的,蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水量较多者，其凝固所需要的温度低，反之，含水份较少者需要高温才能使蛋白质凝固。因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需的温度高。干热灭菌与湿热灭菌的区别干热灭菌与湿热灭菌的区别：在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固，同时水蒸汽穿透力强，水蒸汽的导热性也强。而且当蒸汽与被灭菌的物体接触凝为水时，又可放出热量，使被灭菌物体温度迅速增高，从而增加灭菌效力。高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌锅是一个耐高压又密

6、闭的金属锅。它是利用在密闭条件下产生高压蒸汽来达到灭菌的效果。其温度在100oC以上，有强大的杀菌能力。因此它是一种用途广泛，效率高的灭菌工具。分类：1、卧式 2、立式具体操作步骤：（1）加入适量自来水于灭菌锅中（至水位线）（2）摆入上述包装好的待灭菌的培养基，注意：不要摆得太挤，以免影响蒸汽流通和灭菌效果。（3）加盖旋紧螺旋，使蒸汽锅密闭不漏气（对角线均匀拧旋）（4）打开放气阀，打开电源，自开始产生蒸汽后10分钟（此时蒸汽锅内的冷空气由排气阀排尽）关紧放气阀，让温度随蒸汽压力上升而上升，当达所需压力时（15磅/时2）控制热源维持所需时间（30分钟）然后停止加热，让其自然冷却。（5）待压力降至

7、0磅时，打开排气阀，再打开锅盖，取出灭菌物。注意：压力未降至0磅时，切勿打开锅盖，否则突然降压，招致培养基沸腾，沾湿棉塞，甚至冲出管外。（6）自锅中取出灭菌好的培养基，放置稍冷却后摆成斜面，而后至37oC恒温箱培养24小时，无菌生长，方可保存备用。应用此法灭菌是否彻底的一个重要关键是在压力上升之前，必须将锅内的冷空气完全排尽，否则虽然压力表已指15磅/时，但锅内的温度还只有100oC，结果往往造成灭菌不彻底。斜面摆放示意图：无菌水的制备：用10ml量筒量取9.0的自来水，装入18*180的中号试管中，用100ml量筒量取99ml的自来水装入250ml的三角瓶中，做好棉塞，用牛皮纸包好，高压灭菌

8、，备用。移液管、培养皿的移液管、培养皿的干热灭菌干热灭菌：（1）在移液管尾部塞上少许脱脂棉花，然后用报纸条包好。（2）用报纸条包好干燥的培养皿。（3）将已包好的移液管、培养皿放入电烘箱干热灭菌。干热灭菌是在恒温电箱中进行，它是利用高热空气来达到灭菌效果，因此称干热灭菌。适合玻璃器皿和金属用具的灭菌。带有胶皮的物品，含水份的物质，培养基等不可用这种方法。操作步骤：（1）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通。（2）打开鼓风机、开启电源，当温度100oC时，关闭通气孔，调温度至160oC，借恒温调节器的自动控制调节器，保持此温度12小时。（3）中断电源，待温度降至7

9、0oC以下时，打开箱门，取出灭菌物品。4人一组：（按学号分组）培养皿：每人包5皿。吸管；10支/组。干热灭菌99ml无菌水（玻璃珠），1瓶/组。9ml的无菌水，8支/组。（试管）培养基：220250ml/500ml三角瓶.（2瓶/组）值日：912培养基配制步骤与配方：1、称药2、溶化3、PH值4、过滤5、分装6、做棉塞7、包装8、灭菌牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3g蛋白胨 10gNaCl 5g琼脂 20g水 1000mlPH 7.07.2 121oC 灭菌20分钟试验完成步骤：（4人一组）1、每支试管中加入9ml自来水。8支/组2、装有玻璃珠的三角瓶装入99ml自来水。3、培养基平均分装入2个三角瓶中。4、做棉塞。5、湿热灭菌。6、包移液管。10支/组7、包培养皿。5皿/人8、干热灭菌。4人一组：（按学号分组）培养皿：每人包5皿。吸管；10支/组。干热灭菌99ml无菌水（玻璃珠），1瓶/组。9ml的无菌水，8支/组。（试管）培养基：220250ml/500ml三角瓶。（2瓶/组）值日：912思考作业题：思考作业题：1、总结一下，配制培养基应注意哪些问题。2、高压灭菌的关键是什么？3、干燥灭菌为何要比湿热高温蒸汽灭菌所需的温度高，时间长?4、为何配制培养基后要调节PH值？下次试验：自生固氮菌的分离纯化