实验二 细菌简单染色与革兰氏染色.ppt

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1、实验二实验二细菌的简单染色与革兰氏染色细菌的简单染色与革兰氏染色一、目的要求一、目的要求1、巩固显微镜的使用方法；、巩固显微镜的使用方法；2、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原理和方法。理和方法。二、基本原理二、基本原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所

2、以通常采用碱性染料（如美兰、的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美兰、中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美兰、伊红天青等。伊红天青等。简简单单染染色色法法

3、是是只只用用一一种种染染料料使使细细菌菌着着色色以以显显示示其其形形态态，简简单单染染色色不不能能辨辨别别细细菌菌细细胞胞的的构造。构造。革革兰兰氏氏染染色色法法可可将将所所有有的的细细菌菌区区分分为为革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌（G+）和和革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌（G-）两两大大类类，是是细细菌菌学学上上最最常常用用的的鉴鉴别别染染色色法法，其其是是由由这这两两类类菌菌的的细细胞胞壁壁结结构构和和成成分分的的不不同同所决定的。所决定的。革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较成分成分占细胞壁干重的占细胞壁干重的%革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌肽聚糖肽聚糖

4、含量很含量很高高（50-90）含量很含量很低低（10）磷壁酸磷壁酸含量较高（含量较高（50）无无类脂质类脂质一般一般无无（2）含量较高（含量较高（20）蛋白质蛋白质无无含量较高含量较高vG-菌菌的的细细胞胞壁壁中中含含有有较较多多易易被被乙乙醇醇溶溶解解的的类类脂脂质质，而而且且肽肽聚聚糖糖层层较较薄薄、交交联联度度低低，故故用用乙乙醇醇或或丙丙酮酮脱脱色色时时溶溶解解了了类类脂脂质质，增增加加了了细细胞胞壁壁的的通通透透性性，使使结结晶晶紫紫和和碘碘的的复复合合物物易易于于渗渗出出，结结果果细细菌菌就就被被脱色，再经脱色，再经沙黄沙黄复染后就成红色。复染后就成红色。vG 菌菌细细胞胞壁壁中中

5、肽肽聚聚糖糖层层厚厚且且交交联联度度高高，类类脂脂质质含含量量少少，经经脱脱色色剂剂处处理理后后反反而而使使肽肽聚聚糖糖层层的的孔孔径径缩缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验器材三、实验器材1、材料、材料培培养养12-16h的的金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌，培培养养24小小时时的的大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）2、染色液和试剂、染色液和试剂草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫、碘碘液液、95%乙乙醇醇、沙沙黄黄、二二甲甲苯、香柏油苯、香柏油3、器材、器材废废液液缸缸、洗洗瓶瓶、载载玻玻片片、接接种种环环、酒酒精精灯灯、擦

6、擦镜纸、显微镜等。镜纸、显微镜等。四、实验方法及步骤四、实验方法及步骤1、简单染色、简单染色（1）涂涂片片取取干干净净载载玻玻片片一一块块，在在载载玻玻片片的的左左、右右各各加加一一滴滴蒸蒸馏馏水水，按按无无菌菌操操作作法法取取菌菌涂涂片片，左左边边涂涂金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌，右边涂大肠杆菌右边涂大肠杆菌，注意取菌不要太多。，注意取菌不要太多。（2）晾干）晾干让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固固定定手手执执玻玻片片一一端端，让让菌菌膜膜朝朝上上，通通过过火火焰焰2-3次次固固定定（以不烫手为宜）。（以不烫手为宜）。（4）染染色

7、色将将固固定定过过的的涂涂片片放放在在废废液液缸缸上上的的搁搁架架上上，加加草草酸酸铵结晶紫铵结晶紫或者或者沙黄沙黄染色染色1-2min。（5）水洗）水洗用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液。（6）干燥）干燥将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜镜检检先先低低倍倍观观察察，再再高高倍倍观观察察，并并找找出出适适当当的的视视野野后后，将将高高倍倍镜镜转转出出，在在涂涂片片上上加加香香柏柏油油一一滴滴，将将油油镜镜头头浸浸入入油油滴中仔细调焦观察细菌的形态。滴中仔细调焦观察细菌的形态。涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗镜检镜检简

8、单染色方法简单染色方法干燥干燥2、革兰氏染色、革兰氏染色（1）涂片）涂片与简单染色涂片相同；与简单染色涂片相同；（2）晾干）晾干与简单染色法相同；与简单染色法相同；（3）固定）固定与简单染色法相同；与简单染色法相同；（4）初初染染将将玻玻片片置置于于废废液液缸缸玻玻片片搁搁架架上上，加加适适量量（以以盖盖满满细细菌菌涂涂面面）的的草草酸酸铵铵结结晶晶紫紫染染色液染色色液染色1min；（5）水洗）水洗倾去染色液，用水小心地冲洗；倾去染色液，用水小心地冲洗；（6）媒染）媒染滴加滴加碘液碘液，媒染，媒染1min；（7）水洗）水洗用水洗去碘液；用水洗去碘液；（8）脱脱色色将将玻玻片片倾倾斜斜，连连续续

9、滴滴加加95%乙乙醇醇脱脱色色20-25s至至流流出出液无色，立即水洗；液无色，立即水洗；（9）复染）复染滴加滴加沙黄沙黄复染复染5min；（10）水洗）水洗用水洗去涂片上的沙黄染色液；用水洗去涂片上的沙黄染色液；（11）晾干）晾干将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干；（12）镜镜检检镜镜检检时时先先用用低低倍倍，再再用用高高倍倍，最最后后用用油油镜镜观观察察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。并判断菌体的革兰氏染色反应性。五五注意事项注意事项1、革革兰兰氏氏染染色色成成败败的的关关键键是是酒酒精精脱脱色色。如如脱脱色色过过度度，革革兰兰氏氏阳阳性性菌

10、菌也也可可被被脱脱色色而而染染成成阴阴性性菌菌；如如脱脱色色时时间间过过短短，革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌也也会会被被染染成成革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌。脱脱色色时时间间的的长长短短还还受受涂涂片片厚厚薄薄及及乙乙醇醇用用量量多多少少等等因因素素的的影影响响，难难以以严严格格规规定定，需要多加练习；需要多加练习；2、选选用用幼幼龄龄的的细细菌菌。G+菌菌培培养养12h-16h，G-培培养养24h。若若菌菌龄龄太太老老，由由于于菌菌体体死死亡亡或或自自溶溶常常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。六六思考题及作业题思考题及作业题1、填表、填表2、当当对对未未知知菌菌进进行行革革兰兰氏氏染染色色时时，如如何何保保证证操操作作正确及结果可靠？正确及结果可靠？3、简述革兰氏染色的原理和步骤。简述革兰氏染色的原理和步骤。菌名菌名菌体颜色菌体颜色细菌形态细菌形态结果（结果（G+，G-）大肠杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌球菌球菌杆菌杆菌大肠杆菌大肠杆菌革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌