生物化学课件 第1章 蛋白质的结构与功能.ppt

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1、蛋白质的分子组成The Molecular Component of Protein第第 一一 节节 蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成主要有主要有C、H、O、N和和S。有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量P或金属元素或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo，个别蛋白质还，个别蛋白质还含有含有 I。蛋白质的含氮量平均为蛋白质的含氮量平均为16。通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：通过样品含氮量计算蛋白质含量的公式：蛋白质含量蛋白质含量(g%)=含氮量含氮量(g%)6.25 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点一、氨基酸一、氨基酸 蛋白质的基本组成单位蛋白质的基本组成单位存存在在自自然然界

2、界中中的的氨氨基基酸酸有有300余余种种，但但组组成成人人体体蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸仅仅有有20种种，且均属且均属 L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-氨基酸的通式氨基酸的通式R1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类1.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸3.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸习惯分类方法习惯分类方法1.芳香族氨基酸芳香族氨基酸：Trp、Tyr、Phe2.含羟基氨基酸

3、含羟基氨基酸：Ser、Thr、Tyr3.含硫氨基酸含硫氨基酸：Cys、Met4.杂环族氨基酸：杂环族氨基酸：His5.杂环族亚氨基酸：杂环族亚氨基酸：Pro6.支链氨基酸支链氨基酸：Val、Leu、Ile几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸Gly：无手性碳原子。无手性碳原子。Pro：为环状亚氨基酸。为环状亚氨基酸。Cys：可形成二硫键。可形成二硫键。修饰氨基酸：修饰氨基酸：蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（酸（Hyp）、羟赖氨酸（）、羟赖氨酸（Hyl）。）。非生蛋白氨基酸：非生蛋白氨基酸：

4、蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。的。（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点两性解离及等电点2.紫外吸收紫外吸收 3.茚三酮反应茚三酮反应 二、肽二、肽*肽肽键键(peptide bond)：是是由由一一个个氨氨基基酸酸的的-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的-氨氨基基脱水缩合而形成的化学键。脱水缩合而形成的化学键。（一）肽（一）肽(peptide)多肽链多肽链(polypeptide chain)二肽，三肽二肽，三肽寡肽寡肽(oligopept

5、ide)，多肽，多肽(polypeptide)氨基酸残基氨基酸残基(residue)氨基末端（氨基末端（amino terminal）和羧基末端）和羧基末端（carboxyl terminal）主链和侧链主链和侧链多肽链多肽链 多肽链多肽链（二）（二）几种生物活性肽几种生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)结构结构:谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽三肽谷氨酸的谷氨酸的-羧基羧基形成肽键形成肽键SH为活性基团为活性基团为为酸性肽酸性肽是体内重要的是体内重要的还原剂还原剂GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG G

6、SH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+主要功能主要功能:肽类激素：如促甲状腺素释放激素（肽类激素：如促甲状腺素释放激素（TRH）神经肽神经肽(neuropeptide)2.肽类激素及神经肽肽类激素及神经肽三、蛋白质的分类三、蛋白质的分类 *根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质单纯蛋白质结合蛋白质结合蛋白质 =蛋白质部分蛋白质部分 +非蛋白质部分非蛋白质部分*根据蛋白质形状根据蛋白质形状 纤维状蛋白质纤维状蛋白质球状蛋白质球状蛋白质蛋 白 质 的 分 子 结 构The Molecular Structure of Protein 第第 二二 节节蛋白质的分子结构包括：蛋白质的分子

7、结构包括：一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级结构高级结构定义：定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。排列顺序。一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构主要化学键：主要化学键：肽键肽键二硫键二硫键的位置属于一级结构研究范畴。的位置属于一级结构研究范畴。一级结构是蛋白质空间构象和特异生一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。物学功能的基础。胰岛素的一

8、级结构胰岛素的一级结构3021二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构蛋蛋白白质质分分子子中中某某一一段段肽肽链链的的局局部部空空间间结结构构，即即该该段段肽肽链链主主链链骨骨架架原原子子的的相相对对空空间间位位置置，并并不不涉涉及及氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链的构象的构象。定义：定义：稳定因素稳定因素：氢键氢键 （一）肽单元（一）肽单元 (peptide unit)参参与与组组成成肽肽键键的的6个个原原子子位位于于同同一一平平面面，又又叫叫酰酰胺胺平平面面或或肽肽键键平平面面。它它是是蛋蛋白白质质构构象的基本结构单位。象的基本结构单位。肽单元肽单元HHHH 蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级

9、结构的主要形式 -螺旋螺旋(-helix)-折叠折叠(-pleated sheet)-转角转角(-turn)无规卷曲无规卷曲(random coil)（二）（二）-螺旋螺旋结构要点结构要点:多肽链主链围绕中心轴形成多肽链主链围绕中心轴形成右手螺旋右手螺旋，侧链侧链伸向螺旋外侧。伸向螺旋外侧。每圈螺旋含每圈螺旋含3.6个氨基酸个氨基酸，螺距为，螺距为0.54nm。每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。成的氢键保持螺旋稳定。氢键氢键与螺旋长轴基本平与螺旋长轴基本平行。行。（三）（三）-折叠折叠多肽链充分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯多肽链充

10、分伸展，相邻肽单元之间折叠成锯齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。齿状结构，侧链位于锯齿结构的上下方。两段以上的两段以上的-折叠结构平行排列折叠结构平行排列，两链间可，两链间可顺向平行，也可反向平行顺向平行，也可反向平行。两链间的肽键之间形成氢键，以稳固两链间的肽键之间形成氢键，以稳固-折叠折叠结构。氢键与螺旋长轴垂直。结构。氢键与螺旋长轴垂直。（四）（四）-转角和无规卷曲转角和无规卷曲-转角：转角：无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。无规卷曲：没有确定规律性的肽链结构。肽链内形成肽链内形成180180 回折。回折。含含4 4个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与个氨基酸残基，第一个氨基酸残基与第四

11、个形成氢键。第四个形成氢键。第二个氨基酸残基常为第二个氨基酸残基常为ProPro。-转角：转角：（五）模体（五）模体蛋白质分子中，二个或三个具有二蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个具有特殊功能的空间构象，被称成一个具有特殊功能的空间构象，被称为模体为模体(motif)。螺旋环螺旋螺旋环螺旋 锌指锌指（六）影响二级结构形成的因素（六）影响二级结构形成的因素氨基酸侧链所带电荷氨基酸侧链所带电荷、大小及形状。、大小及形状。影响影响-螺旋形成的因素：螺旋形成的因素：-折叠形成条件：折叠形成条件：要求氨基酸侧链较小。要求氨基酸侧链较小

12、。三、蛋白质的三级结构三、蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和疏水键、离子键、氢键和 Van Van derder WaalsWaals力等。力等。稳定因素：稳定因素：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。定义定义 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)N 端端 C端端纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 结构域结构域(domain)大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧

13、密，各行其功能，称为结构域。行其功能，称为结构域。结构域结构域Triose phosphate isomerase分子伴侣分子伴侣 (chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。成天然构象或形成四级结构的一类蛋白质。*可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可使肽链正确折叠。如此重复进行可使肽链正确折叠。*与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。*对蛋白质分子中二硫键的正确形成起重要的作用。对蛋白质分子中二硫键的正确

14、形成起重要的作用。作用：作用：亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是氢键和离子键。氢键和离子键。四、蛋白质的四级结构四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级蛋白质的四级结构。结构。每条具有完整三级结构的多肽链，称为每条具有完整三级结构的多肽链，称为亚亚基基(subunit)。血红蛋白（血红蛋白（Hb）的四级结构）的四级结构蛋白质结构与功能的关系The Relation of Structure and Function of Protein第第 三三 节节（一）一级结构

15、是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-Val His Leu Thr Pro Glu Glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-Val His Leu Thr Pro Val Glu C(146)这种由蛋白质分子

16、发生变异所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 Hb与与Mb一一样样能能可可逆逆地地与与O2结结合合，Hb与与O2结结合合后后称称为为氧氧合合Hb。氧氧合合Hb占占总总Hb的的百百分分数数（称（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线*协同效应协同效应(cooperat

17、ivity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应。促进作用称为促进作用称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)抑制作用称为抑制作用称为负协同效应负协同效应(negative cooperativity)变构效应变构效应(allosteric effect)凡凡蛋蛋白白质质（或或亚亚基基）因因与与某某小小分分子子物物质质相相互互作作用用而而发发生生构构象象变变化化，导导致致蛋蛋白白质质（或或亚基）

18、功能的变化，称为蛋白质的亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应变构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病 蛋蛋白白质质构构象象病病：若若蛋蛋白白质质的的折折叠叠发发生生错错误误，尽尽管管其其一一级级结结构构不不变变，但但蛋蛋白白质质的的构构象象发发生生改改变变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严严重重时时可可导导致致疾病发生。疾病发生。蛋白质构象病的机理：蛋白质构象病的机理：有些蛋白质错误折有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀

19、的病理改变。粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病疯牛病疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病第四节第四节蛋白质的理化

20、性质与分离纯化The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 一、理化性质一、理化性质 蛋蛋白白质质分分子子除除两两端端的的氨氨基基和和羧羧基基可可解解离离外外，氨氨基基酸酸残残基基侧侧链链中中某某些些基基团团，在在一一定定的的溶溶液液pH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)当当蛋蛋白白质质溶溶液液处处于于某某一一pH时时，蛋

21、蛋白白质质解解离离成成正正、负负离离子子的的趋趋势势相相等等，即即成成为为兼兼性性离离子子，净净电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。利利用用蛋蛋白白质质两两性性电电离离的的性性质质，可可通通过过电电泳泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋蛋白白质质属属于于生生物物大大分分子子之之一一，分分子子量量可可自自1万万至至100万万之之巨巨，其其分分子子的的直直径径可可达达1100nm，为胶粒范围之内。为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗

22、粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 *蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性子的特定空间构象被

23、破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。质改变和生物活性的丧失。造成变性的因素：造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等。变性的本质：变性的本质：破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。（如疫苗等）的必要条件。蛋白质变性后的性质改变：蛋白质变性后的性

24、质改变：溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。生物活性丧失及易受蛋白酶水解。若若蛋蛋白白质质变变性性程程度度较较轻轻，去去除除变变性性因因素素后后，蛋蛋白白质质仍仍可可恢恢复复或或部部分分恢恢复复其其原原有有的的构构象和功能，称为象和功能，称为复性复性。复性复性(renaturation)天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性尿素、尿素、-巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性*蛋白质沉淀蛋白质沉淀在在一一定定条条件件下下，蛋蛋白白疏疏水水侧侧链链暴暴露露在在外外，肽肽链融会

25、相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变变性性的的蛋蛋白白质质易易于于沉沉淀淀，有有时时蛋蛋白白质质发发生生沉沉淀淀，但并不变性。但并不变性。*蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。（四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收由由于于蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有共共轭轭双双键键的的酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸，因因此此在在280nm波波长长处处有有特特征征性性吸吸收

26、收峰峰。蛋蛋白白质质的的OD280与与其其浓浓度度呈呈正正比比关关系系，因因此此可可作作蛋蛋白白质质定定量测定。量测定。（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚也可发生茚三酮反应。三酮反应。双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中蛋白质和多肽分子中肽键肽键在稀碱溶液中与在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水

27、解程度。程度。二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法*透析透析(dialysis)：利用透利用透析袋把大分子蛋白质与小析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。分子化合物分开的方法。*超滤法：超滤法：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。目的。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使使用用丙丙酮酮沉沉淀淀时时，必必须须在在04低低温温下下进进行行，丙丙酮酮用用量量一一般般10倍倍于于蛋蛋白白质质溶溶液液

28、体体积积。蛋蛋白白质质被被丙丙酮酮沉沉淀淀后后，应应立立即即分分离离。除除了了丙丙酮酮以以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。*盐盐析析(salt precipitation)是是将将硫硫酸酸铵铵、硫硫酸酸钠钠或或氯氯化化钠钠等等加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液，使使蛋蛋白白质质表表面面电电荷荷被被中中和和以以及及水水化化膜膜被被破破坏坏，导导致致蛋蛋白白质质沉淀。沉淀。*免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的应的抗原蛋白，并形成抗原抗体

29、复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。原蛋白。（三）电泳（三）电泳蛋蛋白白质质在在高高于于或或低低于于其其pI的的溶溶液液中中为为带带电电的的颗颗粒粒，在在电电场场中中能能向向正正极极或或负负极极移移动动。这这种种通通过过蛋蛋白白质质在在电电场场中中泳泳动动而而达达到到分分离离各各种种蛋蛋白白质的技术质的技术,称为称为电泳电泳(elctrophoresis)。根根据据支支撑撑物物的的不不同同，可可分分为为薄薄膜膜电电泳泳、凝凝胶电泳等。胶电泳等。几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：常用于蛋白质

30、分子：常用于蛋白质分子量的测定。量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳：双向凝胶电泳：是蛋白质组学研究的重要技术。是蛋白质组学研究的重要技术。（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复

31、分配，并以不同离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。*凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析：又称分子筛层析：利利用各蛋白质分子大小不同分离。用各蛋白质分子大小不同分离。（五）超速离心（五）超速离心*超超速速离离心心法法(ultracentrifugation)既既可可以以用用来来分分离离纯纯化化蛋蛋白白质质也也可可以以用用作作测测定定蛋蛋

32、白白质的分子量。质的分子量。*蛋蛋白白质质在在离离心心场场中中的的行行为为用用沉沉降降系系数数(sedimentation coefficient,S)表表示示,沉沉降系数与蛋白质的密度和形状相关降系数与蛋白质的密度和形状相关。三、多肽链中氨基酸序列分析三、多肽链中氨基酸序列分析1.分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成2.测定多肽链的测定多肽链的N端与端与C端的氨基酸残基端的氨基酸残基3.把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析4.测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法5.经过组合排列对比，

33、最终得出完整肽链中氨经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。（一）改进的（一）改进的Sanger法法水解肽链的方法及特征水解肽链的方法及特征裂解剂裂解剂裂解位点裂解位点胰蛋白酶胰蛋白酶Lys、Arg（C）胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶Phe、Tyr、Trp（C）弹性蛋白酶弹性蛋白酶Ala、Gly、Ser、Val（C）胃蛋白酶胃蛋白酶Phe、Trp、Tyr（N）溴化氰溴化氰Met（C）羟胺羟胺AsnGly通过核酸推演的方法通过核酸推演的方法按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列分离编码蛋白质的基因分离编码蛋白质的基因测定测定DNA序列序列排列出排列出mRNA序列序列