实验一 叶绿体色素的分离及理化性质测定(精品).ppt

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1、实验材料实验材料:菠菜叶片菠菜叶片实验一、叶绿体色素实验一、叶绿体色素提取提取分离和分离和理化理化性质性质植物色素：植物色素：植物色素：植物色素：1 1）脂溶性色素：脂溶性色素：叶绿体中叶绿体中叶绿素、类胡萝卜素等叶绿素、类胡萝卜素等 有机溶剂提取，乙醇或丙酮有机溶剂提取，乙醇或丙酮 2 2）水溶性色素：液泡中花青素水溶性色素：液泡中花青素、黄酮类物质黄酮类物质实验目的实验目的：1 1）掌握叶）掌握叶绿绿素的提取方法素的提取方法 2 2）了解叶绿素的理化性质了解叶绿素的理化性质叶绿体中含有叶绿体中含有叶绿体中含有叶绿体中含有绿色素绿色素绿色素绿色素(包括叶绿素包括叶绿素包括叶绿素包括叶绿素a

2、a a a和叶绿素和叶绿素和叶绿素和叶绿素b b b b，酯类化合物，酯类化合物，酯类化合物，酯类化合物)和和和和黄色素黄色素黄色素黄色素【包括包括包括包括胡萝卜素胡萝卜素胡萝卜素胡萝卜素(烃类烃类烃类烃类)叶黄素叶黄素叶黄素叶黄素(衍生的醇类衍生的醇类衍生的醇类衍生的醇类)】两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为相结合，而成为相结合，而成为相结合，而成为色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有

3、机溶剂，故可用乙醇色素蛋白复合体，不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。或丙酮等有机溶剂提取。或丙酮等有机溶剂提取。或丙酮等有机溶剂提取。亲水的亲水的卟啉环的卟啉环的“头头部部”:镁镁原子居于卟啉环的原子居于卟啉环的中中央，带央，带正电性，与其相联正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，因而卟啉具有极性，是亲水是亲水的，可以与蛋白质结合的，可以与蛋白质结合。亲脂的亲脂的叶绿醇的叶绿醇的“尾尾巴巴”:叶叶醇是由四个异戊二醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，烯单位组成的双萜，是一个是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶亲脂的脂肪链，它决定了叶

4、绿素的脂溶性绿素的脂溶性。叶绿体色素提取原理叶绿体色素提取原理叶绿体色素提取原理叶绿体色素提取原理：乙醇提取叶绿体色素乙醇提取叶绿体色素乙醇提取叶绿体色素乙醇提取叶绿体色素：1)1)1)1)取取取取菠菠菠菠菜菜菜菜叶叶叶叶片片片片洗洗洗洗净净净净、擦擦擦擦干干干干、剪剪剪剪碎碎碎碎、混混混混匀匀匀匀，称称称称2g2g2g2g左左左左右右右右，放放放放入研钵中。入研钵中。入研钵中。入研钵中。2)2)2)2)加加加加入入入入少少少少量量量量石石石石英英英英砂砂砂砂及及及及碳碳碳碳酸酸酸酸钙钙钙钙粉粉粉粉，加加加加1 1 1 12 2 2 2滴滴滴滴管管管管95%95%95%95%乙乙乙乙醇醇醇醇，

5、研研研研磨磨磨磨至至至至糊糊糊糊状状状状;再再再再加加加加1010101015ml15ml15ml15ml 95%95%95%95%乙乙乙乙醇醇醇醇，提提取取1 13min3min，过过过过滤于三角瓶中滤于三角瓶中滤于三角瓶中滤于三角瓶中(滤纸用乙醇润湿）滤纸用乙醇润湿）滤纸用乙醇润湿）滤纸用乙醇润湿）3)3)3)3)残渣用残渣用残渣用残渣用5ml5ml5ml5ml 95%95%95%95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。水提取叶绿体色素水提取叶绿体色素水提取叶绿体色素水提取叶绿体色素：取取取取2g2g2g2g剪

6、剪剪剪碎碎碎碎的的的的新新新新鲜鲜鲜鲜叶叶叶叶片片片片，放放放放入入入入少少少少量量量量石石石石英英英英砂砂砂砂(不不不不加加加加碳碳碳碳酸酸酸酸钙钙钙钙粉粉粉粉)，用用用用水水水水研研研研磨磨磨磨。先先先先加加加加2ml2ml2ml2ml蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水，研研研研至至至至糊糊糊糊状状状状，再再再再加加加加蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水20ml20ml20ml20ml，搅匀，搅匀，搅匀，搅匀，不过滤不过滤不过滤不过滤。水水水水 提提提提 取取取取 液液液液 暗暗暗暗 光光光光乙乙乙乙 醇醇醇醇 提提提提 取取取取 液液液液 暗暗暗暗 光光光光 注意：注意：注意：注意：色素乙醇提取液的浓度太大

7、，必须进行稀释才能色素乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能色素乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能色素乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，否则在短时间之内效果不明显。做光破坏实验，否则在短时间之内效果不明显。做光破坏实验，否则在短时间之内效果不明显。做光破坏实验，否则在短时间之内效果不明显。1.1.光对叶绿素的破坏作用光对叶绿素的破坏作用因因因因吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂对对对对不不不不同同同同物物物物质质质质的的的的吸吸吸吸附附附附力力力力不不不不同同同同，当当当当用用用用适适适适当当当当的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂推推推推动动动动时时时时，混混混混合合合合物物物物中中中中各各

8、各各成成成成分分分分在在在在两两两两相相相相(流流流流动动动动相相相相和和和和固固固固定定定定相相相相)间间间间具具具具有有有有不不不不同同同同的的的的分分分分配配配配系系系系数数数数，所所所所以以以以它它它它们们们们的的的的移动速度移动速度移动速度移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。2.提取液中各成分分离：提取液中各成分分离：色层分析的原理：色层分析的原理：色层分析的原理：色层分析的原理：吸附剂：滤纸吸附剂：滤纸吸附剂：滤纸吸附剂：滤纸推动剂：石

9、油醚推动剂：石油醚推动剂：石油醚推动剂：石油醚:丙酮丙酮丙酮丙酮:苯苯苯苯(10:2:1)(10:2:1)(10:2:1)(10:2:1)叶绿体色素的叶绿体色素的叶绿体色素的叶绿体色素的结构结构结构结构决定决定决定决定极性极性极性极性不同，因而在滤纸上的不同，因而在滤纸上的不同，因而在滤纸上的不同，因而在滤纸上的迁移速率迁移速率迁移速率迁移速率不同。不同。不同。不同。1)1)1)1)圆形定性滤纸圆形定性滤纸圆形定性滤纸圆形定性滤纸1 1 1 1张张张张,用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔用细头的吸管在其中心戳一圆形小孔;2)2)2)

10、2)取取取取一一一一张张张张窄窄窄窄滤滤滤滤纸纸纸纸条条条条,沿沿沿沿纸纸纸纸条条条条长长长长度度度度方方方方向向向向涂涂涂涂色色色色素素素素，限限限限制制制制在在在在0.5cm0.5cm0.5cm0.5cm，垂垂垂垂直风干，重复涂抹直风干，重复涂抹直风干，重复涂抹直风干，重复涂抹10101010次。次。次。次。涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。涂抹色素要适量，量多拖尾，量少色带看不清。技巧方法：将浓色素滴到玻璃皿盖上，涂抹纸片技巧方法：将浓色素滴到玻璃皿盖上，涂抹纸片技巧方法：将浓色素滴到玻璃皿盖上，

11、涂抹纸片技巧方法：将浓色素滴到玻璃皿盖上，涂抹纸片 3)3)3)3)沿长度方向卷成纸捻沿长度方向卷成纸捻沿长度方向卷成纸捻沿长度方向卷成纸捻;4)4)4)4)纸捻带纸捻带纸捻带纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，色素一端与滤纸平齐色素一端与滤纸平齐色素一端与滤纸平齐色素一端与滤纸平齐(勿凸出勿凸出勿凸出勿凸出)。2.2.提取液中各成分分离：提取液中各成分分离：4)4)4)4)康维皿放置培养皿内，中央室中加康维皿放置培养皿内，中央室中加康维皿放置培养皿内，中央室中加康维皿放置培养皿内，中央室中加4

12、/54/54/54/5以上的推动剂。以上的推动剂。以上的推动剂。以上的推动剂。5)5)5)5)把把把把带带带带有有有有纸纸纸纸捻捻捻捻的的的的圆圆圆圆形形形形滤滤滤滤纸纸纸纸平平平平放放放放在在在在康康康康维维维维皿皿皿皿上上上上，使使使使纸纸纸纸捻捻捻捻下下下下端端端端浸浸浸浸入入入入 推动剂中。盖好培养皿推动剂中。盖好培养皿推动剂中。盖好培养皿推动剂中。盖好培养皿(为什么为什么为什么为什么)。6)6)6)6)推动剂到达滤纸边缘推动剂到达滤纸边缘推动剂到达滤纸边缘推动剂到达滤纸边缘1/21/21/21/2时，取出滤纸，风干。时，取出滤纸，风干。时，取出滤纸，风干。时，取出滤纸，风干。7)7)

13、7)7)剪下一部分滤纸，附到实验报告中。剪下一部分滤纸，附到实验报告中。剪下一部分滤纸，附到实验报告中。剪下一部分滤纸，附到实验报告中。注意事项：注意事项：1 1 1 1、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。细，匀，直，浓。细，匀，直，浓。细，匀，直，浓。细，匀，直，浓。2 2 2 2、涂抹的色素要适量，量多易拖尾，量少色带弱、涂抹的色素要适量，量多易拖尾，量少色带弱、涂抹的色素要适量，量多易拖尾，量少色带弱、涂抹的色素要适量，量多易拖尾，量少色带弱3 3 3 3、纸捻卷紧；、纸捻

14、卷紧；、纸捻卷紧；、纸捻卷紧；4 4 4 4、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一；5 5 5 5、中心孔小又圆；平齐，勿突出；、中心孔小又圆；平齐，勿突出；、中心孔小又圆；平齐，勿突出；、中心孔小又圆；平齐，勿突出；6 6 6 6、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。7 7 7 7、实验结束后，推动剂倒入到专用回收桶中。、实验结束后，推动

15、剂倒入到专用回收桶中。、实验结束后，推动剂倒入到专用回收桶中。、实验结束后，推动剂倒入到专用回收桶中。从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。实验结果：实验结果：胡萝卜素分子最小，单纯的碳氢化合物，溶解胡萝卜素分子最小，单纯的碳氢化合物，溶解度最大，扩散速度最快；度最大，扩散速度最快；叶黄素中有两个叶黄素中有两个-OH-OH、极性增加，其分子量稍、极性增加，其分子量稍大于胡萝卜素，低于叶绿素，所以扩散速度仅大于胡萝卜素，低于叶绿素，所以扩散速度仅次于胡萝卜素；

16、次于胡萝卜素；叶绿素叶绿素a a、叶绿素、叶绿素b b都有一个亲水的都有一个亲水的“头部头部”，扩散速度慢；扩散速度慢；叶绿素叶绿素a a扩散速度快于叶绿素扩散速度快于叶绿素b(b(醛基醛基)，叶绿素，叶绿素b b扩散的最慢扩散的最慢 。1.1.可渗透物质相可渗透物质相似相溶原理似相溶原理2.2.色素分子的结构和极性共同决定了迁移率的大小色素分子的结构和极性共同决定了迁移率的大小取一支取一支20ml20ml的刻度试管，加入的刻度试管，加入5ml5ml浓的叶绿素乙浓的叶绿素乙醇提取液，观察透射光和反射光的颜色。醇提取液，观察透射光和反射光的颜色。植物叶片是否发射荧光？为什么，如何进行检测？植物叶

17、片是否发射荧光？为什么，如何进行检测？*观察完后保存好试管内提取液，准备皂化反应观察完后保存好试管内提取液，准备皂化反应叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的1010左右，而鲜叶的左右，而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的荧光强度较低，只占其吸收光的0.l0.l1 1。透射光透射光透射光透射光下为翠绿色下为翠绿色下为翠绿色下为翠绿色反射光反射光反射光反射光下为棕红色下为棕红色下为棕红色下为棕红色3 3、叶绿素荧光现象、叶绿素荧光现象620720nm4、皂化作用（、皂化作用（绿绿色素与黄色素的分离）色素与黄色素的分离）C32H30ONMg COO

18、CH3 COOC20H39+2KOH C32H30ON4Mg COOK COOK+CH3OH+C20H39OH 叶叶叶叶绿绿绿绿醇醇醇醇甲醇甲醇甲醇甲醇叶叶叶叶绿绿绿绿素是一种二素是一种二素是一种二素是一种二羧羧羧羧酸酸酸酸-叶叶叶叶绿绿绿绿酸酸酸酸和和和和甲醇和叶甲醇和叶甲醇和叶甲醇和叶绿绿绿绿醇醇醇醇形成的形成的形成的形成的复复复复杂杂杂杂酯酯酯酯，可与，可与，可与，可与碱碱碱碱起皂化反起皂化反起皂化反起皂化反应应应应，生成，生成，生成，生成醇醇醇醇和叶和叶和叶和叶绿绿绿绿酸的酸的酸的酸的盐盐盐盐，产产产产生的生的生的生的盐盐盐盐能溶于水，用此法可将叶能溶于水，用此法可将叶能溶于水，用此法

19、可将叶能溶于水，用此法可将叶绿绿绿绿素与素与素与素与类类类类胡胡胡胡萝萝萝萝卜素卜素卜素卜素分开。分开。分开。分开。操作步操作步骤骤：1 1、叶、叶、叶、叶绿绿绿绿素素素素荧荧荧荧光光光光观观观观察所有察所有察所有察所有试试试试管中，加入管中，加入管中，加入管中，加入1.5ml 20%KOH-1.5ml 20%KOH-甲醇甲醇甲醇甲醇溶液，充分溶液，充分溶液，充分溶液，充分摇摇摇摇匀；匀；匀；匀；2 2、加入、加入、加入、加入5ml5ml苯，苯，苯，苯，摇摇摇摇匀匀匀匀 ；3 3、沿管壁加入适量蒸、沿管壁加入适量蒸、沿管壁加入适量蒸、沿管壁加入适量蒸馏馏馏馏水水水水1-1.5ml1-1.5ml

20、，只需，只需，只需，只需轻轻轻轻微微微微摇动摇动摇动摇动。注注意意：如果分层后下部的溶液浑浊，可以剧烈摇动，对试管水域加温，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。黄色素黄色素黄色素黄色素绿绿绿绿色素色素色素色素5 5、吸收光谱的观察、吸收光谱的观察在光谱中的红光与蓝紫光的部位就会出现很深的黑带，表明这些光线已被叶绿素强烈吸收；而绿光部位没有黑带，也就是未被吸收。胡萝卜素与叶黄素主要吸收蓝紫光，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。如果在阳光与三棱镜之间插入一支盛有叶绿体色素的试管：因此，叶绿素呈现绿色。叶叶叶叶绿绿绿绿素素素素中中中中的的的的MgMgMgMg2+2+2+2+被被被被H H H

21、H+所所所所取取取取代代代代而而而而成成成成褐褐褐褐色色色色的的的的去去去去镁镁镁镁叶叶叶叶绿绿绿绿素素素素铜铜铜铜 取取取取 代代代代 H H H H+形形形形成成成成绿绿绿绿色色色色铜铜铜铜代代代代叶叶叶叶绿绿绿绿素素素素，相相相相对对对对稳稳稳稳定定定定，在在在在光光光光下下下下不不不不易易易易破破破破坏坏坏坏，故故故故常常常常用用用用此此此此法法法法制制制制作作作作绿绿绿绿色色色色多多多多汁汁汁汁植植植植物物物物的浸渍标本的浸渍标本的浸渍标本的浸渍标本6 6、H H+和和CuCu+对叶绿素分子中对叶绿素分子中MgMg+的取代作用的取代作用取出取出取出取出1/21/21/21/2放到放到

22、放到放到 3 3 3 3CK2CK2CK2CK2用乙醇稀释用乙醇稀释用乙醇稀释用乙醇稀释3 3 3 3倍倍倍倍6ml6ml6ml6ml取出取出取出取出1/31/31/31/3放到放到放到放到2 2 2 2CK1CK1CK1CK1加加加加5 5 5 5盐酸盐酸盐酸盐酸1 1 1 1滴，摇匀滴，摇匀滴，摇匀滴，摇匀加入醋酸铜粉末少许加入醋酸铜粉末少许加入醋酸铜粉末少许加入醋酸铜粉末少许不断摇动，加热或手暖不断摇动，加热或手暖不断摇动，加热或手暖不断摇动，加热或手暖3 3 3 3支试管比较观察颜色变化支试管比较观察颜色变化支试管比较观察颜色变化支试管比较观察颜色变化1 1 1 1试管试管试管试管乙醇

23、色素提取液乙醇色素提取液乙醇色素提取液乙醇色素提取液2ml2ml2ml2ml褐色去镁叶绿素褐色去镁叶绿素褐色去镁叶绿素褐色去镁叶绿素绿色铜代叶绿素绿色铜代叶绿素绿色铜代叶绿素绿色铜代叶绿素1.1.1.1.填写记载表、分析、讨论、注意事项填写记载表、分析、讨论、注意事项填写记载表、分析、讨论、注意事项填写记载表、分析、讨论、注意事项2.2.2.2.实验报告：下周三之前交到实验报告：下周三之前交到实验报告：下周三之前交到实验报告：下周三之前交到B-129B-129B-129B-129房间房间房间房间3.3.3.3.下次实验：叶绿体色素的定量测定下次实验：叶绿体色素的定量测定下次实验：叶绿体色素的定量测定下次实验：叶绿体色素的定量测定 B-120 B-120 B-120 B-120 4.4.4.4.洗刷干净，器皿摆放整齐。洗刷干净，器皿摆放整齐。洗刷干净，器皿摆放整齐。洗刷干净，器皿摆放整齐。5.5.5.5.废液回收：废液回收：废液回收：废液回收：含苯色素溶液及推动剂倒入专用回收桶中；含苯色素溶液及推动剂倒入专用回收桶中；含苯色素溶液及推动剂倒入专用回收桶中；含苯色素溶液及推动剂倒入专用回收桶中；乙醇提取液倒入到专用回收桶中。乙醇提取液倒入到专用回收桶中。乙醇提取液倒入到专用回收桶中。乙醇提取液倒入到专用回收桶中。