21 二十一世纪的医学诊疗技术(精品).ppt

《21 二十一世纪的医学诊疗技术(精品).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《21 二十一世纪的医学诊疗技术(精品).ppt（145页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 21 21 二十一世纪医学诊疗技术二十一世纪医学诊疗技术基因诊断与治疗基因诊断与治疗目目 录录18661866清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 人类疾病人类疾病v人类疾病分为遗传性疾病和获得性疾病。v遗传性疾病主要是自身基因结构或表达异常所致。v获得性疾病主要是由环境因素引起。v疾病是环境因素与人体相互作用而形成的一种特殊生命过程，包括“发生、发展、转归”三个阶段。v疾病是环境因素与遗传因素相互作用的结果，即使完全由环境因素所导致的疾病（例如烧伤、烫伤等），其病程长短、修复难易也与个体的遗传类型有关。v任何疾病都与基因有直接或间接的关系，都是特定基因型在一定条件下的表现。目目 录录18

2、671867清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 疾病的诊断治疗疾病的诊断治疗v传统医学是被动的，主要是从环境因素去寻找病因，根据疾病发生后的症状进行诊治。v现代医学是主动的，注重在疾病发生前进行预测，并采取适当措施预防疾病的发生。v基因诊断（gene diagnosis）和基因治疗（gene therapy）技术不仅可以从基因水平上诊断和治疗疾病，而且可以开展个性化的医疗服务。目目 录录18681868清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1 21.1 基因诊断基因诊断v中医“望闻问切”、西医“视触叩听”，还有实验室检查、器械检查等。v传统诊断方法以疾病表型为依据，表型改变不是特异

3、的，在疾病发生一定时间才有表现，不能及时作出明确诊断。v“早期诊断、早期治疗”是临床医生的努力方向。v基因诊断从源头上去查找问题，从基因水平去阐明疾病的病因和发病过程。目目 录录18691869清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.1 21.1.1 基因诊断概述基因诊断概述v基因诊断是采用分子生物学技术来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否正常，以此来对相应的疾病进行诊断。v基因诊断项目一般包括基因序列分析、基因突变检测、基因剂量和拷贝数测定、基因表达产物分析、外源基因检测等。v基因诊断技术分为定性分析和定量分析。定性分析一般用于基因分型、基因突变检

4、测、外源感染性病原体基因检测等；定量分析一般用于测定基因或染色体拷贝数以及基因的表达产物，不同项目的基因诊断应该选择适宜的技术。目目 录录18701870清华版教材医学生物化学与分子生物学课件分子诊断分子诊断v采用分子生物学技术对DNA序列及其表达产物（RNA或蛋白质）进行定性、定量分析，称为分子诊断（molecular diagnosis）。v针对DNA的分子诊断称为DNA诊断（DNA diagnosis）或基因诊断。v对表达产物mRNA质和量的变化进行分析称为RNA诊断（RNA diagnosis）。v对蛋白质的质和量的变化进行分析称为蛋白质诊断（protein diagnosis）。目目

5、 录录18711871清华版教材医学生物化学与分子生物学课件v一般未将基因诊断和分子诊断严格区分，通常所说的基因诊断已经包括RNA和蛋白质诊断的内容。v从技术角度讲，DNA诊断相对较易，蛋白质诊断相对较难。v目前开展的分子诊断主要是针对DNA的，很少将蛋白质作为分析对象。v一般涉及到基因功能分析时，才需要进行RNA诊断。目目 录录18721872清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.1.1 21.1.1.1 形成和发展形成和发展v20世纪70年代初，限制性内切酶的发现和DNA分子杂交技术的建立为基因诊断奠定了基础。v1978年，美籍华裔科学家简悦威（Y.M.Kan）根据胎儿羊水细胞

6、DNA作出镰形红细胞贫血症的产前诊断，开创了基因诊断技术应用于临床的时代。v早期主要针对遗传病，特别是单基因病，具有高度的特异性。前提是疾病表型与基因型关系已经明确。v现在广泛用于各种疾病的诊断，包括肿瘤、病毒感染性疾病、高脂蛋白血症、寄生虫病、传染病病原体的诊断等。目目 录录18731873清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.1.2 21.1.1.2 特点和临床意义特点和临床意义v针对性强：以基因为探查对象，是基因水平的病因诊断。v特异性高：选用特定基因序列作为探针进行分子杂交，能准确探知被检样品中是否存在相应序列。v灵敏度高：PCR技术解决了样品需求量大的难题，极大地提高了灵

7、敏度。v适用面广：检测目标可以是任何一段DNA序列、一个特定基因或一组基因，内源或外源基因，开放或关闭的基因。检测那些具有组织和分化表达特异性的基因。目目 录录18741874清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 临床意义临床意义v诊断疑难疾病：弄清致病基因类型，了解发病过程和机制，对疾病分类分型，提供最佳治疗方案。v预防重大疾病：预测易感因素，提供预防对策。v预测疾病发生：检测感染性流行病病原体，探知不同病原体之间的同源性，为流调提供可靠资料。v血源及各种生物制剂的安全：灵敏地检出携带病毒的细胞。v改善器官移植：分析基因型，有效完成组织配型。v提高人口质量：广泛开展产前基因诊断，杜绝患儿出

8、生，降低发病率。目目 录录18751875清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.1.3 21.1.1.3 原理和技术流程原理和技术流程v基本原理：检测相关基因结构及表达功能，特别是RNA产物是否正常。采用特异DNA探针与靶基因分子杂交，可直接检测上述变化。v技术流程：样品核酸抽提靶序列扩增分子杂交信号检测。v取样：依诊断项目不同而异。利用PCR技术只需采集微量样品就可使其中的DNA大量扩增。v分析：核酸分子探针技术是确认DNA中是否存在某一特定序列的基本方法。PCR技术也可间接分析某一特定序列是否存在。DNA测序或其他DNA结构分析方法可直接确定基因结构及表达产物是否正常。目目 录

9、录18761876清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.2 21.1.2 基因诊断基本策略基因诊断基本策略v如果某种基因突变类型与疾病有直接的因果关系，而且对疾病基因及致病机制已清楚或部分清楚，可直接检测基因突变类型作为诊断依据；v如果疾病基因尚未确定或未被克隆出，对其结构及分子机制一无所知，或者同一疾病存在不同突变类型，可选择基因连锁分析来判断受检者是否带有致病基因；v如果要分析基因的功能是否正常，可选择mRNA进行检测。目目 录录18771877清华版教材医学生物化学与分子生物学课件21.1.2.1 21.1.2.1 基因突变类型的直接诊断基因突变类型的直接诊断v直接诊断方法简

10、单，结果可靠，不依赖家系调查资料，在缺乏家系成员样品时也可对患者进行诊断，是目前诊断遗传病的主要方法。v基因缺失或插入的诊断：Southern印迹法、PCR法。v点突变的诊断：ASO法、RDB法、基因芯片、DHPLC法。v短串联重复序列的诊断。目目 录录18781878清华版教材医学生物化学与分子生物学课件SouthernSouthern印迹法印迹法vSouthern blotting，也称DNA印迹。v基本原理：DNA经限制酶作用后进行琼脂糖凝胶电泳，变性处理后将单链DNA转移到硝酸纤维素膜上，再与核素标记的DNA探针杂交。依据放射自显影片段构成的DNA限制性酶切图谱（条带的大小和数量），可

11、区分正常和突变样品的基因型，并可获得基因缺失或插入片段大小等信息。vSouthern印迹结果可靠，可以显示50bp20kb的DNA片段，是检测大片段基因缺失或插入的经典方法；但操作繁琐，使用放射性核素，难以作为一种常规的临床诊断手段广泛开展。目目 录录18791879清华版教材医学生物化学与分子生物学课件PCRPCR法法v多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）。v几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立在PCR基础上。v基本原理：采用特异引物扩增出目的DNA片段。v一般基因突变区两侧的碱基序列和正常基因相同，根据待测基因两端的DNA顺序设计一对引物，经P

12、CR反应将目的基因片段扩增出来，分析判断致病基因是否存在，了解变异形式。v目前PCR法已有20余种，包括单链构象多态性和异源双链分析法等。目目 录录18801880清华版教材医学生物化学与分子生物学课件PCR-SSCPPCR-SSCP法法v单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism，SSCP）。v基本原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，短的单链DNA和RNA依其大小序列不同形成不同构象，一个碱基的改变将影响构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。v该法简单快速，广泛用于未知基因突变的检测。该法不能测定突变的准确位点，需通过序列分析来确

13、定。v该法特别适合大样本基因突变的筛选，是检测抑癌基因p53突变最常用方法。目目 录录18811881清华版教材医学生物化学与分子生物学课件ASOASO法法v等位基因特异性寡核苷酸分子杂交（allele specific oligonucleotide，ASO）是检测点突变的经典技术。v前提是点突变的确切位置及其基因序列已经明确。v根据已知基因突变位点的核苷酸序列，设计合成包含突变位点在内的一对寡核苷酸探针（A和B），分别针对正常基因和突变基因。两个探针标记后分别与待检DNA样品的扩增产物进行杂交。目目 录录18821882清华版教材医学生物化学与分子生物学课件v正常人的样品只能与A探针杂交，

14、突变纯合子的样品只能与B探针杂交，突变杂合子的样品能与两个探针都杂交。如果被检样品与两个探针都不杂交，表明缺陷基因可能是新的突变类型。vASO法可准确进行已知突变的基因分型，还可发现新的突变基因。vASO法对于突变类型较少的遗传病进行诊断较为快速简便，当一种遗传病存在多种突变类型且频率较分散时，ASO法就有些繁琐。目目 录录18831883清华版教材医学生物化学与分子生物学课件寡核苷酸杂交分析寡核苷酸杂交分析SNPSNP目目 录录18841884清华版教材医学生物化学与分子生物学课件RDBRDB法法v反向点杂交（reverse dot blot，RDB）与ASO的操作相反。v在ASO杂交体系中

15、，待检DNA样品的扩增产物固定在杂交膜上，ASO探针作为流动相与扩增产物进行杂交。v在RDB杂交体系中，针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上，而扩增产物改为液相进行杂交，这样一次可以同时筛查多种突变，大大提高了诊断效率。目目 录录18851885清华版教材医学生物化学与分子生物学课件基因芯片（基因芯片（gene chipgene chip）v又称寡核苷酸微芯片（oligonucleotide microchip），在RDB基础上发展起来。v将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作探针，有规律地排列在硬质小基片（如玻片）上，然后与荧光标记的待测样品的扩增靶序列微杂交，杂交信号经激光共

16、聚焦扫描显微镜捕获，通过计算机进行数据分析并自动报告检测结果。v一个芯片可集成大量基因探针，能高通量地进行，便于自动化操作。目目 录录18861886清华版教材医学生物化学与分子生物学课件基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图目目 录录18871887清华版教材医学生物化学与分子生物学课件DHPLCDHPLC法法v变性高效液相色谱（denature high performance liquid chromatography，DHPLC）。vPCR扩增的单链DNA产物，可随机与互补链结合成双链，观察最终产物中是否出现异源双链来判断待检样品是否存在点突变。v如被测DNA片段不存在点突变，所

17、有的PCR产物都将有相同序列，所有双链DNA都是一致的，只产生一种同源双链。v如待测DNA片段存在点突变，就会产生4种不同的DNA双链分子（2种异源双链、2种同源双链）。目目 录录18881888清华版教材医学生物化学与分子生物学课件v在给定的部分变性洗脱条件下，异源双链的变性程度有别于同源双链，由此造成的DNA分子电荷量等的差异，可以在液相色谱柱中呈现出不同的滞留时间，可将含不同点突变的片段分离成不同特征性洗脱峰而达到检测基因变异的目的。v出现“变异”洗脱峰的样品可进一步通过DNA直接测序，确定样品的突变所在和性质。vDHPLC依赖自动化操作的分析仪完成，是目前临床基因诊断的重要工具。目目

18、录录18891889清华版教材医学生物化学与分子生物学课件短串联重复序列的诊断短串联重复序列的诊断v短串联重复序列（short tandem repeat，STR）的拷贝数扩增（动态突变）是某些遗传病的原因。v脆性X染色体综合征是由于基因组中CGG重复序列扩增所致，正常人的拷贝数为550，症状前携带者的拷贝数为50200，患者的拷贝数超过200。v动态突变病的诊断主要采用PCR方法。以致病靶位点的STR及周围序列为模板，设计合成一对针对STR两侧的寡核苷酸引物，扩增后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳直接检测扩增片段的长度，据此计算STR的拷贝数。目目 录录18901890清华版教材医学生物化学与分子生物

19、学课件21.1.2.2 21.1.2.2 疾病基因相关遗传标志连锁分析疾病基因相关遗传标志连锁分析v一条染色体上所有的基因构成一个连锁群。两个基因靠得越近，连锁就越紧密，由于染色体重组而分开的可能性就越小。v连锁分析（linkage analysis）：利用与致病基因相邻的基因作遗传标志，通过鉴定遗传标志的存在来判断个体是否带有致病基因。v连锁分析属于间接诊断（indirect diagnosis），不直接检测致病基因，无需了解致病基因的结构及分子机制，适宜对大多数由未知基因缺陷引起的遗传病进行诊断。目目 录录18911891清华版教材医学生物化学与分子生物学课件遗传标志遗传标志v进行连锁分析

20、需要足量的家系成员样本，以确定遗传标志与致病基因之间的连锁关系。v选择的遗传标志必须与致病基因紧密连锁，两者之间的距离越小越好，遗传标志必须在人群中存在高度多态性。v高度多态性的遗传标志的数量越多，在基因组中覆盖密度越高，越能满足在更多的染色体位点进行遗传病的连锁分析。v目前已有三代多态性遗传标志用于疾病基因的连锁分析：第一代是RFLP标志；第二代是STR标志；第三代是SNP标志。目目 录录18921892清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 遗传多态性遗传多态性v遗传多态性（genetic polymorphism）指在一个群体中，同时和经常存在两种或两种以上的变异型或基因型，每种变异型超

21、过1定为多态性，不足1的为罕见变异型。v人类遗传多态性包括染色体、酶、蛋白质、抗原、DNA五大类。vDNA多态性分析是人类遗传病诊断的重要手段，是基因诊断的理论基础和检测依据。v人类基因组平均每200对碱基就有1对发生中性突变，导致个体间核苷酸序列不同，表现出DNA的多态性。目目 录录18931893清华版教材医学生物化学与分子生物学课件RFLPRFLP标志标志v限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。v限制酶识别位点发生变异，导致酶切DNA时产生长度不同的片段。v某一RFLP可能只存在于正常染色体，也可能只存在于

22、携带疾病基因的染色体，这种非随机遗传现象称连锁不平衡（linkage disquilibrium）。v在一家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，可用该片段作为一种遗传标志，来判断家庭成员或胎儿是否携带致病基因。v人类基因组约有10万个RFLP位点。目目 录录18941894清华版教材医学生物化学与分子生物学课件STRSTR标志标志v短串联重复序列（short tandem repeat，STR），在人类基因组中广泛分布，总数约有510万个。v最常见是二核苷酸重复，其次是三、四核苷酸重复，如（CA）n、（GT）n、（GC）n、（TC）n、（AGC）n、（CAG）n等，其中以（CA）

23、n、（GT）n 最多，约3060kb就存在一个（CA）n或（GT）n。v不同个体或不同染色体中的STR复制数相差悬殊，形成高度的遗传多态性。除了部分同卵双生子，个体之间的STR都不相同。目目 录录18951895清华版教材医学生物化学与分子生物学课件SNPSNP标志标志v单个碱基变异所致，在人群中普遍存在。人类基因组至少有300万个SNP位点，平均5001000个碱基就有一个，几乎在任何致病基因附近都可以找到SNP位点。vSNP变异类型简单，易于进行自动化检测，因此SNP检测更适合在大规模的连锁分析中发挥作用。v国际上多家大型医药公司和学术界组成的SNP联盟，正在绘制人类基因组的高密度SNP图

24、谱。目目 录录18961896清华版教材医学生物化学与分子生物学课件根据遗传标志进行连锁分析根据遗传标志进行连锁分析vRFLP连锁分析：建立在RFLP基础上，与家系分析相结合的连锁分析技术。vSTR连锁分析：STR和RFLP都用Southern印迹杂交进行连锁分析，采用方法相同，但遗传标志不同。vSNP连锁分析：SNP的表现形式是个别碱基差异，不是DNA片段长度差异。SNP连锁分析是以序列变异为检测信息，是检测基因序列点突变，点突变分析技术可用于SNP分析。vSNP分析要面对大量SNP位点，对自动化操作提出更高要求。目目 录录18971897清华版教材医学生物化学与分子生物学课件RFLPRFL

25、P连锁分析连锁分析v基本原理：利用疾病基因与同一条染色体上的某一RFLP之间的连锁不平衡而进行的间接分析。v利用家系中患病个体的染色体上，与致病基因紧密连锁的RFLP所导致的限制性位点的丢失或获得作为遗传标志，通过基于RFLP分析的Southern印迹分析，间接推断后代是否遗传了致病基因。v对于基因突变尚不明确的家系，拟采用RFLP连锁分析进行基因诊断，即采用与突变基因连锁的位点（+）为标志来间接诊断致病基因。vRFLP连锁分析主要用于较大基因且突变类型不清楚的单基因遗传病的基因诊断，如杜氏肌营养不良和血友病A等。目目 录录18981898清华版教材医学生物化学与分子生物学课件RLFPRLFP

26、分析法原理示意图分析法原理示意图目目 录录HinHind d18991899清华版教材医学生物化学与分子生物学课件STRSTR连锁分析连锁分析vSTR拷贝数在人群中存在广泛变异，并不改变STR及两翼碱基组成，只要核心序列一致，就可利用相同限制酶将不同拷贝数的STR切下来。v不同个体STR拷贝数不同，形成不同长度DNA片段，采用Southern印迹杂交可区分不同长度的DNA片段，根据被测家系每个成员STR图谱上的多态性条带，间接推断个体是否遗传了与STR相连锁的致病基因。vSTR分析较RFLP分析更为简便有效，广泛用于遗传病的连锁分析和基因定位、亲子鉴定和刑侦样品的确认或排查等方面。目目 录录1

27、9001900清华版教材医学生物化学与分子生物学课件vSTR连锁分析与PCR相结合，形成了一种更为简便灵敏的替代方法，即扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP，Amp-FLP）连锁分析。v只需要通过PCR扩增致病基因内部或两侧的STR，经电泳检测扩增片段长度的多态性，即可快速作出诊断。目目 录录19011901清华版教材医学生物化学与分子生物学课件SNPSNP连锁分析连锁分析v单个SNP位点提供的信息有限，只有两种碱基的变化。SNP连锁分析多采用多个基因座位的SNP进行“单倍型”分析。v单倍型（haplotype）来源于“单倍

28、基因型”（haploid genotype），指一条染色体上顺式排列的等位基因座位。v根据同一染色体上一组或全部SNP位点的随机组合类型来分析，称基于SNP的单倍型分析（SNP-based haplotyping）。目目 录录19021902清华版教材医学生物化学与分子生物学课件v以SNP的单倍型为遗传标志，通过家系调查可进行致病基因的连锁分析或遗传制图；通过基于群体的SNP单倍型分析，可以寻找疾病易感基因。v如果被测群体中某些SNP单倍型，或某些SNP位点的组合频率显著高于预期频率时，即可判断为非随机相关的连锁不平衡事件。v采用多位点进行SNP分析，可避免因染色体互换、重排等偶然现象造成的错

29、误，提高遗传分析和基因诊断准确性。目目 录录19031903清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.2.3 RNA21.1.2.3 RNA诊断诊断vRNA诊断主要分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高低以及转录物的大小。vNorthern印迹（Northern blot）即RNA印迹，是检测基因是否表达以及表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可判断基因表达效率。vRT-PCR是检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，与荧光定量PCR结合，可对RT-PCR产物量进行准确测定。目目 录录19041904清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1

30、.3 21.1.3 基因诊断的应用基因诊断的应用v从临床诊断到血清诊断，从生化诊断到基因诊断，诊断技术发展已历经4代。v基因诊断技术能诊断疾病、预测疾病、指导用药、评价疗效。v几乎所有疾病都与基因有直接或间接关系，都能从基因水平进行诊断和预测。目目 录录19051905清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.3.1 21.1.3.1 诊断疾病诊断疾病v基因诊断从检测基因入手，对遗传性疾病是检测内源基因，对获得性疾病是检测外源基因，通过基因检测数据的综合分析，再结合其他诊断方法，从而对疾病作出判断。v基因诊断最初主要是针对遗传病的，根据不同遗传病的分子基础，采用不同技术方法进行诊断。v

31、获得性疾病主要是指感染性疾病（infectious diseases），因感染了病原体而致病。v病原体包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫等。目目 录录19061906清华版教材医学生物化学与分子生物学课件地中海贫血（简称地贫）的基因诊断地中海贫血（简称地贫）的基因诊断v地贫是最常见、发生率最高的一种单基因遗传疾病（monogenic disease），由于一种或几种珠蛋白合成障碍，导致类与类珠蛋白不平衡造成发病。v最常见有两类：地贫（-thalassemias）和地贫。v地贫主要是珠蛋白基因缺失，部分病例是由于碱基突变造成的。v采用限制酶图谱方法，可检测珠蛋白基因的

32、缺失。目目 录录19071907清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 人人珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇v位于16号染色体，长度29kb，包含7个连锁的类基因或假基因。v1基因与2基因编码序列相同，产物也相同，仅非编码序列稍有差别。v该基因簇上有2个EcoR I识别位点，经Eco R I酶解，进行Southern印迹，用标记的基因片段作探针，得到一条23kb的杂交条带。该基因簇上有4个Bam H I识别位点，但只有14 kb片段能与mRNA基因探针杂交。目目 录录19081908清华版教材医学生物化学与分子生物学课件HbHb Bart Barts s胎儿水肿综合征胎儿水肿综合征v患儿2条16号染色

33、体的4个珠蛋白基因均缺失，不能合成链。v胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常于妊娠3040周死亡，或早产后半小时内死亡。v胎儿DNA经限制酶图谱分析，不能显示珠蛋白基因区带。RNA诊断也测定不出有珠蛋白基因的mRNA。目目 录录19091909清华版教材医学生物化学与分子生物学课件其他血红蛋白病其他血红蛋白病v缺失型HBH病：1条16号染色体上2个珠蛋白基因均缺失，另1条16号染色体上缺失一个珠蛋白基因，并缺失3.7kb长度的DNA片段（右侧缺失型），或4.2kb片段（左侧缺失型），DNA诊断显示19kb长度的Eco R I片段，或10kbBam H I片段。v标准型地贫：1条16号染色体上2

34、个珠蛋白基因全部缺失，另1条16号染色体上有2个正常的珠蛋白基因，DNA诊断结果，Eco R I和Bam H I都出现与正常一样的23kb或14kb的条带，但杂交条带的放射自显影较正常人浅。v地贫：珠蛋白基因通常不缺失，由于基因点突变或个别碱基插入或缺失。目目 录录19101910清华版教材医学生物化学与分子生物学课件染色体病的基因诊断染色体病的基因诊断v危害严重，过去主要依据临床表现、核型分析和生化检查进行诊断，耗时费力，缺乏特异性。v采用定量PCR扩增技术，可快速诊断三体综合征。v采用多色荧光标记的FISH探针技术，一次可同时诊断多种染色体病，可检测出小至50kb的染色体微小异常（缺失、插

35、入和易位等），大大提高了染色体病诊断的敏感性和效率。目目 录录19111911清华版教材医学生物化学与分子生物学课件肿瘤的基因诊断肿瘤的基因诊断v肿瘤是体细胞遗传病，发生和发展过程相当复杂，其中癌基因和抑癌基因的结构和表达的异常是病变的重要因素。v观察不同类型的肿瘤细胞发现，有的癌基因ras在固定位点上发生高比率点突变；有的癌基因myc放大；有的丢失了抑癌基因；有的发生了基因重排等。v对肿瘤进行基因诊断，可以研究细胞癌变的机制，对肿瘤进行分类分型，指导抗癌。目目 录录19121912清华版教材医学生物化学与分子生物学课件感染性疾病的基因诊断感染性疾病的基因诊断v病原体：包括病毒、细菌、真菌、支

36、原体、衣原体、立克次体、螺旋体以及寄生虫等。v诊断样本：是病原体特异性核酸（DNA或RNA）序列。v诊断目的：通过分子杂交和基因扩增等手段，发现和鉴定这些独特的外源基因组、基因或基因片段在人体组织中是否存在，从而证实是否感染了某种病原体。目目 录录19131913清华版教材医学生物化学与分子生物学课件病原体的检测病原体的检测v主要采用PCR技术。v对病原体的DNA用PCR技术直接检测，一般根据病原体特异的和保守的序列设计引物，有的还需合成ASO探针。v对RNA病毒采用RT-PCR法。v已有多种病原体的测定药盒，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以及配妥的各种反应试剂，并附有操作说明。

37、目目 录录19141914清华版教材医学生物化学与分子生物学课件传统方法和传统方法和基因诊断比较基因诊断比较v传统病原体检测包括病原体培养、形态学观察和免疫学检测等，都有局限性。分离培养需要较长时间；形态学观察难以满足大量标本检测的要求；免疫学方法检测抗体不能用于早期诊断。v基因诊断应用范围广。PCR扩增和分子杂交等方法可用于各种病原体的检测。可以检出正在生长的病原体，也能检出潜伏的病原体；能确定既往感染，也能确定现行感染。对不易体外培养和安全培养的病原体，也可用基因诊断检测。v基因诊断简便、快速、经济。无需分离培养病原体，实验周期短，检测成本相对较低。目目 录录19151915清华版教材医学

38、生物化学与分子生物学课件v基因诊断直接检测病原体遗传物质，提高了诊断的敏感性和特异性，便于定量操作。v基因诊断可在症状尚未出现前检测出病原体，有利于疾病的早诊早治和预防。v基因诊断只能判断病原体的有无和拷贝数的多少，难以检测病原体进人体内后机体的反应及结果。v基因诊断并不能完全取代传统方法，需要和其他方法相互补充，才能对疾病作出正确判断。目目 录录19161916清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.3.2 21.1.3.2 预测疾病预测疾病v对有遗传病危险的胎儿，在妊娠早期和中期甚至胚胎着床前，进行产前诊断和携带者的检测，防止患儿出生，预防性优生。v产前诊断的目的是预防和监测胎儿

39、发生与病原体感染相关的出生缺陷，是基因诊断的重要内容。v对高危家系进行遗传咨询和产前诊断，预防遗传病患儿出生，是降低遗传病发生率和群体遗传负荷（genetic load）的主要途径。目目 录录19171917清华版教材医学生物化学与分子生物学课件产前诊断方法产前诊断方法v第一类是采用特殊仪器检查胎儿体表是否有畸形，如X线照片、体表造影或B超等间接观察，或胎儿镜直接观察。属于形态学水平。v第二类是采用母血、尿等进行特殊检查，间接诊断胎儿先天性疾病。母体孕期，少量胎儿血细胞、可扩散的代谢产物、蛋白质和酶等物质，可通过胎盘进入母体血液循环系统。v第三类是直接获取胎血、羊水或组织来诊断胎儿疾病。v三类

40、检查可从形态学、染色体、酶学、代谢产物和基因五个水平，进行产前诊断。目目 录录19181918清华版教材医学生物化学与分子生物学课件产前基因诊断产前基因诊断v对采自胎儿羊水、绒毛或脐血等来源的DNA，进行基因型或染色体核型分析。v主要针对某些常见的染色体病和单基因遗传病，如21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征、地中海贫血、囊性纤维化、镰状细胞贫血症、苯丙酮尿症、血友病、进行性肌营养不良症和脆性X综合征等。v引起人类出生缺陷的多种感染性疾病的病原体也是产前诊断的目标。目目 录录19191919清华版教材医学生物化学与分子生物学课件植入前遗传学诊断（植入前遗传学诊断（PGD）vPGD（p

41、reimplantation genetic diagnosis），PGD是辅助生殖技术与基因诊断技术结合的孕前诊断技术。v对配子或移入官腔前的胚胎进行快速遗传学分析，筛选出健康配子或胚胎，避免异常妊娠。v对遗传病高危人群进行PGD，避免因遗传因素造成反复流产，避免遗传病或有缺陷的患儿出生。vPGD可避免诊断操作带来流产、宫腔感染等，避免异常胚胎的治疗性流产。v1989年，Handyside等首次采用PCR技术，对有高风险传递X-连锁隐性遗传病的夫妇进行了PGD，1990年诞生了世界上首例经PGD操作的健康婴儿。目目 录录19201920清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 PGDPGD的技

42、术基础的技术基础v体外受精与胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）、荧光原位杂交技术（fluorescent in situ hybridization，FISH）或各种形式的PCR。vFISH是筛查染色体病的常规手段，可在植入前对所有染色体异常的胚胎进行筛查，阻断染色体病发生。体外受精胚胎染色体异常高达30。vFISH技术主要集中在三体综合征和性染色体数目异常的筛查上。vFISH还可鉴定胚胎性别，避免性连锁疾病。vPCR技术用于大多数单基因病的植入前基因诊断。目目 录录19211921清华版教材医学生物化学与分子生物学课

43、件遗传筛查遗传筛查v针对特定人群的系统检查，确定哪些个体携带有某一特定疾病的基因，为被检对象或其子女提供疾病易感性、患病风险的相关信息。v可在新生儿、婚前或早、中孕期进行，以发现疾病基因携带者或症状前患者。v新生儿筛查可发现症状前患儿，及早采取预防和治疗措施，延缓或阻断疾病的发生。v婚前或孕期筛查为杂合子筛查，为隐性遗传病高风险家庭患病风险分析提供指导，如胎儿为某种严重遗传病的纯合子，应建议终止妊娠。目目 录录19221922清华版教材医学生物化学与分子生物学课件v遗传筛查是群体预防计划的重要环节，主要针对某些常见的或有严重后果的遗传病。v遗传筛查涉及大量样本分析，应选廉价而可靠的测试方法。v

44、目前主要采用表型分析法进行筛查，如地贫筛查项目，包括平均红细胞体积（MCV）和血红蛋白A2，当MCV80fl，Hb A22.5时，可初诊为地贫基因携带者，还需要进行DNA分析明确诊断。目目 录录19231923清华版教材医学生物化学与分子生物学课件分子筛查分子筛查v分子诊断技术以其快速简便和自动化的优势，为人群筛查提供了有效手段。v分子筛查与表型筛查相比，更直接、准确，是未来遗传筛查的方向。v对于静止型地贫携带者，采用上述MCV和HbA2表型指标，不能准确诊断杂合子，分子筛查只需通过PCR扩增，直接检测个体的基因组是否缺少了一个珠蛋白基因。目目 录录19241924清华版教材医学生物化学与分子

45、生物学课件对获得性疾病的预测对获得性疾病的预测v病原体突变或外来毒株入侵常导致某些疾病地域性流行，用传统方法只能确定血清型别，不能深入了解相同血清型内各分离株的遗传差异。v基因诊断可确定相同血清型中不同地域、不同年份分离株的同源性和变异性，有助于研究病原体遗传变异趋势，研究疾病暴发流行的规律。v1971年Nahmias于提出“TORCH”，指发生在孕期的各种微生物感染。目目 录录19251925清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 “TORCHTORCH”的含义的含义字头 英文全称及缩写 中文名称 T Toxoplasmagondii，Tox 弓形虫 O Others 其他病原体 R Rub

46、ellavirus，RV 风疹病毒 C Cytomegalovirus，CMV 巨细胞病毒 H Herpes simples Virus，HSV 单纯疱疹病毒 目目 录录19261926清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 21.1.3.3 21.1.3.3 其他应用其他应用v疗效评价及用药指导。v个体识别和亲子鉴定。目目 录录19271927清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 疗效评价疗效评价v白血病容易复发，根源主要在于患者体内残留少数的白血病细胞（约0.5109L）。v染色体分析和基因诊断技术可监测白血病患者体内残留的少数白血病细胞。是预测白血病复发、判断化疗效果和制定治疗方案的重

47、要参考。vFISH技术最可靠，PCR技术最敏感，可检测出单拷贝的基因模板，简单快速，为临床上检测和跟踪微小残留病（minimal rudimental disease，MRD）的常规方法。目目 录录19281928清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 指导用药指导用药v一般医生开药是根据平均值确定的，但人在疾病的不同阶段，对药量的需求不一样。v药物吸收量取决于肝代谢水平。v人基因组之间存在0.1%的区别，不同人肝代谢水平不一样。v如果肝无法吸收药物，那么多吃的药物完全就是浪费，甚至会出现不良反应。v药物作用个体差异是由于药物代谢酶类的遗传多态性，或者是先天性基因多态性。目目 录录192919

48、29清华版教材医学生物化学与分子生物学课件v测定人体基因多态性或其单倍型，可以预测药物代谢情况或疗效，制订针对不同个体的药物治疗方案，提高疗效，减少药物不良反应。v深入研究药物代谢酶类及相关药物治疗靶点的基因多态性，阐明人类所有与药物代谢酶类及相关蛋白编码基因的遗传多态性，设计出对其进行基因诊断的有效方法。v用药选择和剂量个体化，是临床药物治疗的发展方向。v基因诊断可以发现每个人对药量的精确需求，帮助医生制定个性化的治疗方案。目目 录录19301930清华版教材医学生物化学与分子生物学课件个体识别和亲子鉴定个体识别和亲子鉴定v传统检测：血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜抗原（HLA）等，都

49、有不确定因素。v有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定。v人类基因组中许多位点，存在可变串联重复序列（variable number of tandem repeat，VNTR）。v某些VNTR是由2050个重复单位组成，每个单位含15100 bp，DNA的长度为15kb，较普通卫星DNA（约100 kb）小，称为小卫星DNA（minisatellite DNA）。目目 录录19311931清华版教材医学生物化学与分子生物学课件vVNTR有高度多态性，在人群中的分布表现出高度的个体特异性，同一个体同源染色体的等位VNTR的重复单位数也不同。vVNTR区的重复单位数不同，该区的DNA

50、长度也不同。但每一位点VNTR的核心序列高度保守，可将VNTR作为鉴别个体的一种遗传标记。目目 录录19321932清华版教材医学生物化学与分子生物学课件 DNADNA指纹图谱指纹图谱v1985年，Jeffreys选择某些核心序列作探针，选用在核心序列无切割位点的限制酶（如HinF I）对DNA样品进行酶解，然后作Southern印迹。图谱显示不同个体具有不同条带，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，这种Southern印迹图称DNA指纹图谱（DNA fingerprint）。vDNA指纹的基础是DNA的多态性。每个人的DNA序列都有差异，具有高度个体特异性和终生稳定性。v除同卵双生子有相同图