02.组织培养细胞的生物学(精品).ppt

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1、组织培养细胞的生物学组织培养细胞的生物学组织培养细胞的生物学组织培养细胞的生物学第二章第二章Contents细胞生存环境和代谢附着底物人工培养基教学教学内容内容1235体内、外细胞的差异和分化体外培养细胞的分型细胞相互关系细胞系（株）的建立87643组织培养细胞的生长和增殖过程2023/1/242 在个体发生过程中，细胞通过不断的生长和繁殖，数在个体发生过程中，细胞通过不断的生长和繁殖，数量增多，与此同时发生着分化。量增多，与此同时发生着分化。分化：分化：及细胞在形态和功能上由一般发展到特殊的过程，及细胞在形态和功能上由一般发展到特殊的过程，由于分化的结果，形成了各种组织和器官。由于分化的结果

2、，形成了各种组织和器官。一、体内、外细胞的差异和分化一、体内、外细胞的差异和分化2023/1/243因模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，因模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，易发生以下变化：易发生以下变化：分化现象减少，形态和功能趋于单一，生存一定时分化现象减少，形态和功能趋于单一，生存一定时间后衰退死亡或发生转化，变成有间后衰退死亡或发生转化，变成有无限生长能力无限生长能力的的连续细胞系连续细胞系或或恶性细胞系恶性细胞系。如：腺细胞分泌机能丧失，肌细胞纤维细胞化。如：腺细胞分泌机能丧失，肌细胞纤维细胞化。原因：原因：细胞在人工培养以后，可能导致很多基因关细胞在人工培养以后，可能

3、导致很多基因关闭，而导致分化闭，而导致分化 停止、功能丧失。停止、功能丧失。可以利用这一点，来研究基因表达和调控。可以利用这一点，来研究基因表达和调控。（一）差异（一）差异2023/1/244体外培养细胞分化能力并未完全丧失，只是因环境改变其体外培养细胞分化能力并未完全丧失，只是因环境改变其分化表现和原体内不同。分化表现和原体内不同。如：体内：成纤维细胞、骨细胞如：体内：成纤维细胞、骨细胞胶原胶原 体外：成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、体外：成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞肿瘤细胞胶原。胶原。如何揭示细胞分化的条件，阐明分化调控的机制是主要的。如何揭示细胞分化的条件，阐明分化调控的机制

4、是主要的。（二）分化（二）分化2023/1/245据能否贴附在支持物上生长的性质，分：据能否贴附在支持物上生长的性质，分：2、悬浮型(ES细胞，老鼠，初生培养；荧光，DAPI染色剂)1、贴附型(心肌细胞，老鼠，初生培养)二、体外培养细胞的分型二、体外培养细胞的分型2023/1/246培养时能贴附在支持物上生长，大多数细胞呈贴附型生长。培养时能贴附在支持物上生长，大多数细胞呈贴附型生长。特点：特点：1 1、分化现象变得不显著，易失去它们在体内时的原有特征。、分化现象变得不显著，易失去它们在体内时的原有特征。2 2、形态上常表现单一化的现象，并常反映其胚层起源，类似、形态上常表现单一化的现象，并常

5、反映其胚层起源，类似所谓所谓“返祖返祖”现象。现象。如：起源于如：起源于内、外胚层内、外胚层的细胞多呈的细胞多呈上皮型。上皮型。中胚层中胚层-呈呈成纤维细胞型。成纤维细胞型。体外培养细胞的形态常表现有一般化的倾向。因此，判定细体外培养细胞的形态常表现有一般化的倾向。因此，判定细胞形态很难按体内细胞标准确定，仅大致分成胞形态很难按体内细胞标准确定，仅大致分成以下几类：以下几类：（一）贴附型（一）贴附型2023/1/247 与体内成纤维细胞的形态相似而得名。心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮（中胚层间充质起源）都呈此形态。成纤维细胞型1 1、成纤维细胞型、成纤维细胞型2023/1/248 起源于内、

6、外胚层细胞。如：皮肤表皮，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等。上皮细胞型2 2、上皮细胞型、上皮细胞型2023/1/249此型不稳定，有时难与其它细胞相区别。游走细胞型3 3、游走细胞型、游走细胞型2023/1/2410 除上述三型外，其它难以确定它们规律和形态的，统归为“多形细胞型”。如：神经组织的细胞。多型细胞型4 4、多形细胞型、多形细胞型2023/1/2411 培养细胞的形态受多种因素的影响，如：温度，二氧化碳，酸、碱、密度等。如：Hela细胞，本属上皮型，但过酸、过碱变成梭形。上皮细胞数量少时，呈星形或三角形。数量多时，呈上皮型。它来源于美国的Helen Lane，她1951年死于子宫颈

7、癌2023/1/2412培养时，不贴附与支持物上，而呈悬浮状态生长。如：某些癌细胞、白细胞。其优点：细胞生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢研究。S180细胞（二）悬浮型（二）悬浮型2023/1/2413 体外培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液。这一过程称“传代”。每次传代都要影响细胞生长过程。另外，体外生存期一般也不是无限的。（一）组织培养细胞生命期（二）组织培养细胞一代生长过程（三）细胞周期三、组织培养细胞的生长和增殖过程三、组织培养细胞的生长和增殖过程2023/1/2414 培养细胞生命期，是指细胞在培养中持

8、续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。大多生存一年左右，传3050代，相当150300个细胞周期，在全生存过程中大致经历以下三个阶段：1、第I期-原代培养期（初代培养期）从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，约14周。与体内细胞性状相似，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等。为保持二倍体体细胞性质，应在初代或传代后早期冰冻。（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期2023/1/24152、第II 期-传代期 初代培养细胞一经传代后，便称做“细胞系”。此期，是生命期中持续时间最长、细胞增殖旺盛，呈二倍体核型的细胞系称“二倍体细胞系”3、第III期-衰退期

9、 细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，最后衰退死亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在不明原因的影响，细胞可能发生自发转化。标志之一，是细胞获得不死性即持久性增殖能力，这样的细胞群体称“无限细胞系”。主要发生在II期，核型大多变成异倍体，转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性而无恶性。（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期2023/1/2416 初代培养 有限细胞系 无限细胞系接种培养第一次传代传代 传代间隔老化死亡转化指数细胞数量0 2 4 6 8 10 12 16 周 22 20 18 16 14 12 10 8 62023/1/2417 所有体外培养细胞，

10、包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与接种数量、细胞生物学性状以及营养液的性质等有关。细胞的“一代”仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如：某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代或倍增不同。在细胞一代中，细胞能倍增36次（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2023/1/2418细胞传一代后，一般要经过以下几个阶段：1、游离期（悬浮期）2、贴壁期3、潜伏期4、指数生长期5、停止期（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程来源：人体肾脏 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁 注释：该细

11、胞含腺病毒5 DNA 2023/1/24191、游离期（悬浮期）细胞接种后，在培养液中呈悬浮状态的阶段，细胞胞质回缩，胞体变成圆形。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2023/1/24202、贴壁期：细胞附着于支持物上。原代细胞：24h内贴壁。连续细胞系：530分钟贴壁。单个细胞快于细胞团、组织块。贴壁与许多因素有关：培养基的酸度、污染，胶塞和培养器皿的清洁度，细胞本身的活性等等。血清中有许多促使细胞贴壁的冷析球蛋白（CIG）和纤粘素（FN）CIG与多聚赖氨酸联用，有利于细胞迅速贴壁。贴壁后细胞变成放射延展细胞极性细胞再经过一个潜伏期阶段后，才进入生长期。细胞的贴壁和

12、延展（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2023/1/24213、潜伏期：此时，细胞有生长活动，而无细胞分裂。原代细胞潜伏期：2496h 或更长。连续细胞系、肿瘤细胞潜伏期短：仅624h。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，进入指数生长期。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2023/1/24224、指数生长期（对数生长期）此时期，细胞增殖旺盛，细胞数成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。此阶段可用细胞群体倍增时间、细胞分裂指数（MI）等来判断。MI：细胞群中每1000个细胞中的分裂细0.20.5%，连续细胞系、肿瘤细胞的MI 可高达35%。持

13、续35天，细胞数量增多，最后生长面积消失，细胞相互接触连接成片。此时，细胞由于相互接触而发生“接触抑制”。表现为细胞扩展运动停止。保证细胞不重叠生长。肿瘤细胞无接触抑制特征，能相互重叠，向三维空间发展，只要原因充分，细胞仍能分裂、增多。正常细胞生长汇合成单层时，细胞达到一定密度，细胞停止分裂，这种现象称“密度抑制”。导致细胞停止分裂。（二）组织培养细胞一代生长过程（二）组织培养细胞一代生长过程2023/1/24235、停止期：数量已达饱和，停止增殖，但仍有代谢活动，营养枯竭，代谢产物积累，PH降低，细胞会中毒。通常，细胞长满瓶底80%时即传代，接种到23个新瓶中。（二）组织培养细胞一代生长过程

14、（二）组织培养细胞一代生长过程2023/1/24242023/1/2425是指细胞每一次增殖所经历的全过程。每经过一个增殖周期，数量就增加一倍。据细胞周期不同时期的生化特点，可划分为四个连续 的时期：G1期（DNA合成前期）细胞间期 S 期（DNA合成期）主要是DNA的复制。G2期（DNA合成后期）M期（有丝分裂期）：完成染色体的分配。细胞完成一次细胞周期所需要的时间称为-“细胞周期时间”。（三）细胞周期（三）细胞周期2023/1/2426 S期：DNA合成期间期：是细胞代谢、DNA复制旺盛时期。G1、G2：两个间隙 有丝分裂：细胞核及其染色体分裂。细胞分裂期：胞质分裂：细胞质分裂成两个子细胞

15、。2023/1/2427有丝分裂过程2023/1/2428细胞生长的速度与细胞周期时间有关。正常细胞和肿瘤细胞相比较，细胞周期时间大致相接近的。如：人的正常肠上皮细胞的细胞周期时间是：13天。人的结肠癌细胞的细胞周期时间是：2.5天。急性白细胞的细胞周期时间是24天。正常白细胞的细胞周期时间是1天。所不同的是：正常细胞的增殖达到一定限度就停止了，而且增殖的细胞基本上相当于丢失的细胞数，总数始终保持相对恒定。肿瘤细胞是以持续的无限制增殖、永不停止。一般说来，哺乳动物的细胞周期为1030 h，其中间期约10 h。（三）细胞周期（三）细胞周期2023/1/2429 在体外培养中，单个细胞也能生存和生

16、长，有很大的独立性，但不是细胞永久存在的形式，不能长期生存，只有群体细胞才是细胞的基本存在形式。体外培养细胞间仍具有形态和功能的相互依存关系，细胞上仍有桥粒、缝隙连接，一旦两相邻细胞发生接触，便呈接触抑制现象，导致运动停止。四、细胞相互关系四、细胞相互关系2023/1/2430v无污染环境v温度v气体环境和氢离子浓度v基本营养物质v促生长因子、激素v渗透压五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2023/1/2431（一）无污染环境 无菌、无毒是保证细胞生存的首要条件。（二）温度：35370C 39400C中1 h，有一定损伤，但仍可以恢复。41420C 中1 h，细胞严重损伤，但不致全部

17、杀死，仍有可能恢复。430C时，很多细胞被杀死。温度00C：能抑制细胞代谢，并无伤害作用。40C数小时370C培养，细胞仍能生长。温度降至冰点以下，细胞可因胞质结冰而死亡。在培养液中加一定量保护剂（二甲基亚砜或甘油），封入安瓿中后，冻于液氮中，-1960C，能长期贮存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长，细胞的生物性状不受任何影响，此为细胞保存的主要手段。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2023/1/2432（三）气体环境和氢离子浓度（三）气体环境和氢离子浓度所需气体主要有O2，CO2。1、O2：参与三羧酸循环，供能。缺O2，多数不能生长。一般，95%空气加5%CO2混合气体。O2 分压

18、太高，对细胞也有毒害作用。2、CO2：既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，与维持培养液的PH有直接关系。大多数细胞PH7.27.4，但各种细胞对PH的要求也不完全相同。原代细胞一般对PH变动耐受性差，无限细胞系耐受性强。总的来说，细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸中更有利于生长。如：原代羊水细胞，PH6.8时最适。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2023/1/2433细胞在生长过程中，不断释放CO2，培养液变酸，为维持培养液中PH的恒定，最常用的方法是加磷酸盐缓冲剂 其中，NaHCO3 CO2能调节CO2的含量。NaHCO3+H2ONa+HCO3-+H2 ONa+H2CO3 +OH-

19、Na+OH-+H2 O+CO2。CO2易于逸出，只适用于封闭式培养。开瓶培养时，需在5%CO2 气体环境中（CO2 培养箱）。为克服NaHCO3的缺点，也可用Hepes（羟乙基派嗪乙硫磺酸）它对细胞无毒性，是具有较强缓冲能力的氢离子缓冲剂。主要能稳定和抵抗快速PH变化。其最大优点：开瓶通气观察也能维持PH值。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2023/1/2434（四）基本营养物质（四）基本营养物质1 1、糖：、糖：葡萄糖、核糖、丙酮酸。葡萄糖、核糖、丙酮酸。2 2、1212种基本氨基酸：种基本氨基酸：精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸

20、、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸、缬氨酸。酪氨酸、缬氨酸。谷氨酰胺：谷氨酰胺：作为氮源、碳源，能促进各种氨基酸进入细胞。作为氮源、碳源，能促进各种氨基酸进入细胞。3 3、维生素：、维生素：VitVit A A、D D、E E、K K、B B族、族、C C。4 4、无机盐：无机盐：FeFe+、ZnZn+、CuCu+。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2023/1/2435（五）促生长因子、激素（五）促生长因子、激素如：胰岛素如：胰岛素-促进葡萄糖、氨基酸的吸收。促进葡萄糖、氨基酸的吸收。氢化可的松氢化可的松-细胞粘着，增殖。细

21、胞粘着，增殖。（六）（六）渗透压渗透压7.67.6个大气压（个大气压（57765776mmHgmmHg）=770KPa=770KPa。五、细胞生存环境和代谢五、细胞生存环境和代谢2023/1/2436 半固体培养基半固体培养基按按物理性状物理性状：液体培养基液体培养基-最主要的。最主要的。按按来源分：来源分：天然培养基：天然培养基：合成培养基合成培养基+血浆、血清、胎汁。血浆、血清、胎汁。合成培养基：合成培养基：据细胞所需的严格配制。据细胞所需的严格配制。无血清培养基：无血清培养基：增添促细胞生长因子。增添促细胞生长因子。六、人工培养基六、人工培养基2023/1/2437 除少数悬浮型细胞外，

22、绝大多数体外培养细胞需除少数悬浮型细胞外，绝大多数体外培养细胞需附着在附着在适宜的底物上适宜的底物上才能生长。才能生长。细胞贴附底物生细胞贴附底物生长的性质长的性质称称“锚着依赖性锚着依赖性”。原则上讲，凡对细胞无毒性的物质，都可用作底原则上讲，凡对细胞无毒性的物质，都可用作底物。但不同的细胞对底物的要求各异，底物不合物。但不同的细胞对底物的要求各异，底物不合适，细胞生长不良。适，细胞生长不良。玻璃玻璃一次性塑料一次性塑料微载体微载体饲细胞（也称滋养细胞）饲细胞（也称滋养细胞）七、附着底物七、附着底物2023/1/2438（一）玻璃（一）玻璃是最常用的培养底物，透明、便于观察、洗涤，能反复使用

23、，是最常用的培养底物，透明、便于观察、洗涤，能反复使用，质地以质地以中性玻璃中性玻璃为上，适合于各种细胞附着生长。为上，适合于各种细胞附着生长。缺点：缺点：易破碎。易破碎。（二）一次性塑料（二）一次性塑料聚苯乙烯。聚苯乙烯。经加工处理，表面具有亲水性，经加工处理，表面具有亲水性，聚四氟乙烯。聚四氟乙烯。七、附着底物七、附着底物2023/1/2439（三）微载体（三）微载体由由聚苯乙烯聚苯乙烯和和聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺制成的小球体，附着面大，有制成的小球体，附着面大，有利于大量繁殖细胞。利于大量繁殖细胞。天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）作载体，直径作载体，直径 50 50 um

24、um或数或数百百umum不等，不等，如：微载体培养系统。如：微载体培养系统。（四）饲细胞（也称滋养细胞）（四）饲细胞（也称滋养细胞）可用可用小鼠成纤维细胞小鼠成纤维细胞或或其它细胞其它细胞长成单层后，再用大剂长成单层后，再用大剂量射线照射，使细胞失去增殖力，但还存活，仍能进量射线照射，使细胞失去增殖力，但还存活，仍能进行代谢活动，可支持其它细胞生长。行代谢活动，可支持其它细胞生长。七、附着底物七、附着底物2023/1/2440（一）常用术语（一）常用术语1 1、细胞培养：、细胞培养：单个细胞在体外条件下的生长。单个细胞在体外条件下的生长。2 2、组织或器官培养：、组织或器官培养：是指组织、器官

25、在体外的维持或生长，它们可以是指组织、器官在体外的维持或生长，它们可以分化并保持原来的结构或功能。分化并保持原来的结构或功能。3 3、外植块：、外植块：用于开始体外培养而切下的一小块组织或器官。用于开始体外培养而切下的一小块组织或器官。4 4、细胞系：、细胞系：原代培养物经首次传代成功后即成原代培养物经首次传代成功后即成细胞系细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代数有限如果细胞系不能继续传代或传代数有限-有限细胞系有限细胞系。如果细胞系可连续传代如果细胞系可连续传代-连续细胞系连续细胞系，即已建成的细胞系。即已建成的细胞系。八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2023/1/24415 5

26、、细胞一代时间、细胞一代时间：单个细胞两次连续分裂的时间间隔。单个细胞两次连续分裂的时间间隔。6 6、再培养：、再培养：单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基的过程。基的过程。7 7、原代培养：、原代培养：从机体取得材料（细胞、组织或器官）从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。代培养。8 8、传代培养或传代：、传代培养或传代：指将细胞从一个培养容器移植指将细胞从一个培养容器移植到另一培养容器中培养。到另一培养容器中培养。八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立

27、2023/1/2442（二）建立细胞系（株）的要求（二）建立细胞系（株）的要求 限于初代培养的细胞，只要供体均一，取材部位及组织种限于初代培养的细胞，只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定，则无须多项鉴定。类等条件稳定，则无须多项鉴定。长期使用，特别是反复传代的细胞，有以下一些长期使用，特别是反复传代的细胞，有以下一些要求：要求：1 1、组织来源、组织来源2 2、细胞生物学检测、细胞生物学检测3 3、培养条件和方法、培养条件和方法八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2023/1/24431、组织来源：所属物种（人或动物）、性别、年龄、所取的器官组织等。如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断、以及病理号。2、细胞生物学检测：如：细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线、分裂指数、倍增指数、接种率等。如为肿瘤细胞，应力求说明细胞确系来源于肿瘤组织。3、培养条件和方法：指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜PH值。八、细胞系（株）的建立八、细胞系（株）的建立2023/1/24442023/1/2445