胚胎保存.ppt

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1、卵母细胞与胚胎保存江苏畜牧兽医职业技术学院胚胎保存的意义n胚胎的保存就广义上说，就是设法在体外把胚胎暂时贮存起来而不使其失去活力。n1、使胚胎移植具有更大的灵活性和实用性。n2、进行远距离运输，解决家畜引种时运输活畜的困难。n3、建立动物基因库（胚胎库）。胚胎与精子细胞结构差异n胚胎数量极少n胚胎体积比精子大很多(精子为9um,卵子直径为120um),细胞质多,外包特殊膜透明带。n胚胎结构结构和新陈代谢过程更为复杂（精子为单细胞，胚胎为多细胞，受精卵随第二极体的排出，新陈代谢逐步加强）。n胚胎孕育着新的生命（娇嫩）。胚胎保存方法n异种活体保存n37度保存n常温保存n低温保存n冷冻保存（三）常温

2、保存n常温保存是指胚胎在1525温度下于培养液中保存。这种温度下胚胎能保存24h，随时间的延长其活力下降，此方法只能做短暂的保存和运输。（四）低温保存n不同动物的胚胎对温度的反应不同，小鼠、家兔和羊的胚胎冷却到0仍能存活，而猪胚胎抗低温能力较差。目前认为，低温保存一般以510较好。几种哺乳动物适宜保存的参考温度分别是：小鼠510、家兔10、绵羊10、山羊510、牛06。而猪胚胎对低温较敏感，在15以下易受低温打击而影响活力，所以猪胚胎保存一般在1520为宜。（五）冷冻保存冷冻保存原理n胚胎冷冻保存关键是要设法减少细胞内冰晶形成所致的损伤。胚胎冷冻保存实际上是一个脱水过程，在胚胎冷冻前，要尽量减

3、少胚胎细胞内的水分。n当胚胎在降到一定温度时，首先是细胞外溶液形成冰晶，而细胞内尚未结冰，处于超冷状态。随着细胞外液冰晶逐渐增大，细胞外液的渗透压升高，导致细胞内水分向外渗出而产生所谓“溶液效应”。n此时可能发生两种情况：（1）如果冷冻速度很慢，细胞膜内能充分的渗出，因此细胞内不能形成冰晶。n如果冷冻速度过慢，细胞就有充分的时间向细胞外渗透水分，使细胞内部溶质浓度增高，允许有更深的过冷度。结果细胞脱水，细胞皱缩，细胞内部长时间处于高浓度溶液(主要为电解质)状态下，这种高浓度的电解质作用于细胞膜，引起脂蛋白复合物的变性和部分类脂质的丢失，增加了细胞膜对阳离子的通透性，在细胞膜上形成一些小孔，解冻

4、时，水大量进入细胞造成细胞渗透性休克损伤。n（2）如果冷冻速度过快，当温度下降至某一临界点，细胞内水分未能及时向外渗出，就会导致细胞内形成冰晶。在-5-15细胞内液处于超冷状态时，如细胞尚未充分脱水，一旦结冰，冰晶将会迅速集聚，引起温度瞬间剧增，对细胞产生相当大的损伤性冰晶损伤。渗透性保护剂n主要作用机制：与水结合后，使水的冰点下降，使之不易形成冰晶，从而起到冷冻保护作用。n分子量小，可通过细胞膜进入细胞内，如GL、EG、DMSO、PG(1，2丙二醇）。非渗透性保护剂n主要作用机制：通过提高细胞外液渗透压，使细胞内的水分充分外流，使胚胎在冷冻过程中减少冰晶的形成，从而达到冷冻保护的目的。n分子

5、量大，在冷冻过程中不进入细胞内，如蔗糖、聚蔗糖、海藻糖和棉子糖等多元醇。单一冷冻保护剂的效果依次为：EG，DMSO，GL（甘油）超低温冷冻保存的一般程序超低温冷冻保存方法的种类玻璃化冷冻法n玻璃化冷冻法是RALL和FAHY（1985）建立的一种快速，简捷而又有效的超低温冷冻法。n它采用高浓度冷冻保护剂组成的玻璃化液（渗透和非渗透性保护剂相结合），这种溶液在低温下变粘稠，不发生结晶即可固化，此固体物质能保持分子和离子正常的液态分布，是一种超快速冷冻模式。n主要的冷冻保护剂是DMSO（二甲基亚砜）和EG（乙二醇）。n普遍认为EFS溶液（EGF（聚蔗糖）为最好的玻璃化。1、开放式拉管法nVajta（

6、1998）首次报道采用OPS冷冻牛卵母细胞获得解冻后25%的囊胚率。OPS管来自冻精细管，将冻精细管拉制为原内径一半，利用毛细现象将胚胎和微量玻璃化液吸入管后，直接投入液氮保存。与传统细管玻璃冷冻法相比，OPS在冷冻和解冻过程中的速度高十倍（约20000/min),使细胞快速通过危险温区，减少冷冻损伤；操作更简便；胚胎在微量（15ul）保护液中，有效减少了保护剂毒性并且提高了降温速率。2、开放式毛细玻管法n此方法首次由Kong（2000）运用于小鼠胚胎玻璃化冷冻，其效果和OPS无明显差别。不过玻璃管壁薄，导热性强，降温和复温速率比OPS更高，投入液氮也不象OPS管那样容易炸裂；玻璃比塑料密度大

7、，在液氮中不象OPS管那样浮起；毛细玻管可自行拉制，内径范围远比OPS管宽。由于GMP玻璃化冷冻胚胎的原理和操作与OPS法相似，加之上述优点，GMP法显得更便利。n玻璃化冷冻法的共同优点：设备简单，花费少，冷冻效果好。几种哺乳动物胚胎超低温冷冻方法哺乳动物卵母细胞超低温冷冻保存方法胚胎冷冻仪胚胎解冻n常规的解冻操作如下：将胚胎取出放入解冻液，3235恒温水浴解冻。解冻液通常是较高浓度的非渗透性溶剂，如蔗糖溶液。n蔗糖在稀释细胞内保护剂时起缓冲渗透压的作用，维持了细胞外液较高的渗透压，使细胞内保护剂渗出，同时控制细胞外水分渗入的速度和渗入量，防止因水分的迅速渗入而导致细胞过度膨胀，减少了细胞渗透性休克现象发生。n过冷现象：当溶液温度降到冰点时，不发生结冰现象，而待降到冰点以下一定温度时才发生结冰，这种现象称过冷现象。n植冰（诱发结晶）：当溶液温度稍低于冰点时，撒入晶母或强行冷却可以促使溶液结冰，使溶液瞬间渡过冰点温度，防止过冷现象的产生，这种促使溶液结冰的方法就称为诱发结晶或植冰。各种动物胚胎冷冻植冰温度n小鼠：-3.5-5n兔子：-4-5 n羊：-5-6 n牛：-7 左右