核酸的提取(精品).ppt

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1、第一部分：第一部分：DNADNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNADNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策教学内容教学内容第三部分：第三部分：RNARNA提取方法简介提取方法简介第四部分：第四部分：RNARNA提取及其提取及其RT-PCRRT-PCR常见常见 问题、原因分析及其对策问题、原因分析及其对策第二部分：第二部分：DNADNA提取常见问题、提取常见问题、原因分析及其对策原因分析及其对策 核酸是核酸是18691869年米歇尔年米歇尔(F.MiescherF.Miescher)在脓液在脓液 白细胞中发现的，他白细胞中发现的，他当时称之为核素。阿当时

2、称之为核素。阿尔特曼尔特曼(R.AltmannR.Altmann)于于18891889年认识其酸性年认识其酸性后，定名为核后，定名为核 酸。酸。核酸分为核糖核酸核酸分为核糖核酸 (RNA)(RNA)和脱氧核糖核和脱氧核糖核酸酸(DNA)DNA)两大类。两大类。核酸的发现核酸的发现核核 酸酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。分子，携带和传递遗传信息。是遗传信息的载体，是最重要的生物是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学

3、实验技术中因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作最重要、最基本的操作 。核酸的分类及分布核酸的分类及分布 90%90%以以上上分分布布于于细细胞胞核核，其其余余分分布布于于核外核外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNADNA遗传信息的表达。遗传信息的表

4、达。某些病毒某些病毒RNARNA也可作为遗传信息也可作为遗传信息的载体。的载体。核酸的理化性质核酸的理化性质l晶形 DNADNA为白色纤维状固体为白色纤维状固体 RNARNA为白色粉末状固体为白色粉末状固体l两性解离 呈酸性呈酸性 在中性溶液中带负电荷在中性溶液中带负电荷l溶解性 均溶于水均溶于水 不溶于一般有机溶剂不溶于一般有机溶剂,在在70%70%乙醇中形成沉淀乙醇中形成沉淀 0.14MNaCl0.14MNaCl 12MNaCl12MNaCl DNA-DNA-蛋白蛋白 溶解度溶解度低低 溶解度溶解度高高 RNA-RNA-蛋白蛋白 溶解度溶解度高高 溶解度溶解度低低l粘度粘度 DNADNA粘

5、度粘度大大(因其分子直径小而长度大因其分子直径小而长度大)RNARNA粘度粘度小小 核酸变性或降解后粘度降低核酸变性或降解后粘度降低l旋光性旋光性 均很强均很强l密度密度 RNARNA双链双链DNADNA；环状环状DNA DNA 开环、线状开环、线状DNADNA 单链单链DNA DNA 双链双链DNA DNA l沉降速度：沉降速度：RNARNA 环状环状DNA DNA 开环、线状开环、线状DNADNA核酸分离、纯化原则核酸分离、纯化原则意义：遗传信息全部储存意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的在一级结构之中，核酸的级结构还决定其高级结级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物构的形式以

6、及和其他生物大分子结合的方式。大分子结合的方式。分离核酸原则：分离核酸原则：温度不要太高温度不要太高控制控制pHpH值范围值范围(pH(pH值值5-9)5-9)保持一定离子强度保持一定离子强度减少物理因素对核酸的机减少物理因素对核酸的机械剪切力械剪切力.保持核酸分子一级结构保持核酸分子一级结构的完整性的完整性防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解细胞内或外来的各种核酸细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结二酯键，破坏核酸一级结构构。所用器械和一些试剂需高所用器械和一些试剂需高温灭菌温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶提

7、取缓冲液中需加核酸酶抑制剂抑制剂金属离子螯合剂：金属离子螯合剂：DNADNA酶需要金属二价离酶需要金属二价离子子Mg2+Mg2+、Ca2+Ca2+的激活，的激活，因此使用金属二价离因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制子螯合剂，可抑制DNADNA酶活性。如酶活性。如EDTA-EDTA-Na2(Na2(乙二胺四乙酸二乙二胺四乙酸二钠钠)、8-8-羟基喹啉；羟基喹啉；阴离于型表面活性剂阴离于型表面活性剂 如如SDSSDS，该试剂除对核，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，带负电荷的复合物，该复合物在高

8、盐溶液该复合物在高盐溶液中沉淀提取缓冲液中中沉淀提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂需加核酸酶抑制剂DNADNA酶抑制剂酶抑制剂RNARNA酶（酶（RNAase)RNAase)抑制剂抑制剂皂土（皂土（bentonitebentonite）：皂土带负电荷，能吸附皂土带负电荷，能吸附RNaseRNase，使其失活。，使其失活。DEPC(DEPC(二乙基焦碳酸盐二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中HisHis结结 合使蛋白变性。合使蛋白变性。使用注意使用注意：1.DEPC1.DEP

9、C也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大但浓度比使蛋白质变性的浓度大10010010001000倍。倍。2.2.容易降解，保存在容易降解，保存在4 4 或液氮中；或液氮中；3.3.提提RNARNA时，时，0.1%DEPC0.1%DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h37 2 h。4.4.剧毒。剧毒。肝素肝素复合硅酸盐（复合硅酸盐（Macaloid)Macaloid)RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-(Vanadyl-Ribonucleoside Com

10、plex,VRC)Ribonucleoside Complex,VRC)DNADNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备材料准备最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，要选时，要选择有核细胞（白细胞）择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组

11、培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNADNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体拷贝或大质粒，则应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解

12、细胞裂解经典的裂解液几乎都含有经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐去污剂和盐盐的作用盐的作用提供一个合适的裂解环境提供一个合适的裂解环境 抑制样品中的核酸酶抑制样品中的核酸酶去污剂去污剂 使蛋白质变性使蛋白质变性蛋白酶蛋白酶裂解液裂解液裂解方法裂解方法机械法机械法化学试剂法化学试剂法反复冻融法反复冻融法酶解法酶解法确保彻底裂解样品确保彻底裂解样品使裂解体系中核酸浓度适中使裂解体系中核酸浓度适中以样品中蛋白质的含量为基准以样品中蛋白质的含量为基准裂解液的用量原则裂解液的用量原则含蛋白酶的裂解方法：基因组含蛋白酶的裂解方法：基因组DNADNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RN

13、ARNA含含CTABCTAB的裂解法：的裂解法：富含多糖的样品的基因组 DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA裂解方法评价裂解方法评价细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNADNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡螯合剂螯合剂基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒

14、质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5 5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有复性时间也不宜过长，否则会有基因组基因组DNADNA的污染的污染G G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化核酸分离、纯化q蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）异硫氰酸胍等）SDSSDS除

15、有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；使核酸从蛋白质上游离出来的功能；高盐洗涤高盐洗涤 核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaClNaCl后，破坏静电吸力，使后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处理蛋白酶处理q酚酚/氯仿抽提氯仿抽提酚氯仿混合使用能增酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色时氯仿具有去除植物

16、色素和蔗糖的作用。素和蔗糖的作用。在酚在酚/氯仿抽提核酸提取氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉异戊醉=25=25：2424：1 1）。）。q注意事项注意事项酚通常是透明无色的结酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二

17、酯键。核酸的磷酸二酯键。安全操作安全操作 酚腐蚀性很强，并可引酚腐蚀性很强，并可引 起严重的灼伤，操作时起严重的灼伤，操作时 应戴手套。应戴手套。q多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积)，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替

18、乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG200l 20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰浴冰浴20min20min。核酸分离、纯化核酸分离、纯化q多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防

19、止酚类与DNADNA的结合的结合核酸分离、纯化核酸分离、纯化q盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解优点：优点：改变核酸的溶解缓冲液；改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。乙醇乙醇 优点：优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：缺点：需要量大，一般要求低温操作。需要量大，一般要求低温操作。异丙醇异丙醇 优点：优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的需体积小，速度快，适于浓度低

20、、体积大的DNADNA样品沉淀。一般不需低温。样品沉淀。一般不需低温。缺点：缺点：易使盐类、蔗糖与易使盐类、蔗糖与DNADNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用7070乙醇漂洗。乙醇漂洗。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）优点：优点：可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量的选择沉淀不同相对分子质量的DNADNA片段。应用片段。应用60006000相对分子质量相对分子质量 的的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，使用浓度与沉淀时，使用浓度与DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意：PEGPEG沉淀一般需加沉

21、淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol/L10 mmol/L的的MgCl2MgCl2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。精胺精胺 不是有机溶剂，但可快速有效沉淀不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝缩在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNADNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNADNA的目的。的目的。有机沉淀剂有机沉淀剂核酸沉淀的盐类及浓度核酸沉淀的盐类及浓度盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)m

22、ol/L)终浓度终浓度(mol/L)(mol/L)MgClMgCl2 21 10.010.01NaAcNaAc3(pH5.2)3(pH5.2)0.30.3KAcKAc3(pH5.2)3(pH5.2)0.30.3NHNH4 4AcAc10102.52.5NaClNaCl5 50.20.2LiClLiCl8 80.80.8 当核酸溶液的当核酸溶液的pHpH值大于值大于4 4时，核酸分子呈多聚阴离子时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与状态，它与1 1价或价或2 2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。不溶解，也不会被有机溶剂变性。核酸沉淀的温度和

23、时间核酸沉淀的温度和时间低温沉淀能提高沉淀的效率低温沉淀能提高沉淀的效率低温长时间沉淀，易导致盐与低温长时间沉淀，易导致盐与DNADNA共沉淀。共沉淀。一般使用一般使用00冰水，冰水，10-15min10-15min，DNADNA样品足样品足可达到实验要求。可达到实验要求。如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀原则上不要使用低温沉淀核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/101/10体积的体积的NaAcNaAc（

24、pH5.2pH5.2，3M3M），），有利于充分沉淀有利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用7070的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等 一定要将沉淀悬浮起来；一定要将沉淀悬浮起来；要控制一定的时间要控制一定的时间 少量多次；少量多次；去上清要彻底。去上清要彻底。晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）核酸溶解核酸溶解RNA RNA 以以DEPCDEPC水为主水为主DNADNA 用用TETE：EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNase；pHpH值为值为8.08.0，可，可防止防止DNADNA

25、发生酸解发生酸解核酸的保存核酸的保存 稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。-20-20 或或70 70 保存保存核酸的检测问题核酸的检测问题紫外分光光度仪紫外分光光度仪电泳检测电泳检测核酸在核酸在260nM260nM左右有最大的吸收峰左右有最大的吸收峰样品要纯，无蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染；样品要纯，无蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染；浓度应浓度应大于大于0.25 g/ml 0.25 g/ml。1OD1OD值相当于值相当于 双链双链DNADNA浓度为浓度为50g/ml50g/ml；单链单链DNADNA为为37g/ml37g/ml；RNARNA为为40g

26、/ml40g/ml。测定步骤测定步骤吸取一定量的核酸样品吸取一定量的核酸样品加水稀释到一定的体积加水稀释到一定的体积转入到比色皿转入到比色皿校正零点校正零点测定测定230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值值计算浓度计算浓度分析纯度分析纯度纯的纯的DNADNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280应为应为1.81.8，OD260mOD260mOD230OD230应大于应大于2.02.0OD260/OD280OD260/OD280大于大于1.91.9：RNARNA污染污染OD260/OD280OD260/OD280小于小于1.61.6：蛋白质或

27、酚：蛋白质或酚OD260/OD230OD260/OD230小于小于2.02.0：盐和小分子杂质：盐和小分子杂质可能出现既含蛋白质又含可能出现既含蛋白质又含RNARNA的的DNADNA溶液比值为溶液比值为1.81.8的情况。的情况。纯的纯的RNARNA样品样品OD260/OD280OD260/OD280应界为应界为1.7-2.01.7-2.0，OD260mOD260mOD230OD230应大于应大于2.02.0OD260/OD280OD260/OD280大于大于2.02.0：异硫氰酸胍异硫氰酸胍污染污染OD260/OD280OD260/OD280太小：蛋白质或酚太小：蛋白质或酚OD260/OD2

28、30OD260/OD230小于小于2.02.0：盐和小分子杂质：盐和小分子杂质可能出现既含蛋白质又含可能出现既含蛋白质又含RNARNA的的DNADNA溶液比值为溶液比值为1.81.8的情况。的情况。电泳检测电泳检测l观察琼脂凝胶中观察琼脂凝胶中DNADNA的的最简单方法是利用荧光最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌该物质含有一个可以嵌入入DNADNA的堆积碱基之间的堆积碱基之间的一个平面基团，这个的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致碱基的密切接近，导致染料与染料与DNADNA结合并呈现结合并呈现荧光，其

29、荧光产率比游荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。离染料溶液有所增加。DNADNA提取的几种方法提取的几种方法q基因组基因组DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它DNADNA提取的几种方法提取的几种方法q非基因组非基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNADNA的提取的提取 差速离心结合差速离心结合SDSSDS裂解法裂解法基因组基因组DNADNA CTABCTAB法法qCTABCTAB法原理法原理（植物（植物DNADNA提取经典方法）提取经典方法）CTABCTAB（hexadecyltrim

30、ethylammoniumhexadecyltrimethylammonium bromide bromide，十六烷基三甲基溴化十六烷基三甲基溴化铵铵），），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。注：注：CTABCTAB溶液在低于溶液在低于1515 时会

31、形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于1515。qCTABCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份组份 Tris-Tris-HClHCl （pH8.0pH8.0）EDTA EDTA（pH8.0pH8.0）NaCl NaCl CTAB CTAB-巯基乙巯基乙醇醇 终浓度终浓度 100 100 mMmM 20 20 mMmM 1.4M 1.4M2%(W/V)2%(W/V)0.1%0.1%（V/VV/V）使用前加使用前加入入Tris-HClTris-HCl （pH8.

32、0pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTAEDTA螯合螯合MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNase活性；活性；NaClNaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNPDNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTABCTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除qCTABCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组

33、份组份 Tris-HClTris-HCl （pH8.0pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少络合物质，有效去除多酚，减少DNADNA中酚的污染；同时它也能和多中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。糖结合，有效去除多糖。qCTABCTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液

34、上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNADNA溶液溶液q SDS法原理法原理基因组基因组DNADNASDSSDS法法SDSSDS是是一一种种阴阴离离子子去去垢垢剂剂，在在高高温温（55556565）条条件件下下能能裂裂解解细细胞胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提提高高盐盐(KAcKAc或或NHNH4 4Ac)Ac)浓浓度度并并降降低低温温度度（冰冰浴浴），使使蛋蛋白白质质及及多多糖糖杂杂质沉淀，离心后除去沉淀；质沉淀，离心后除去沉淀；上上清清液液中中的的DNADNA用用酚酚/氯氯仿仿抽抽提

35、提，反反复复抽抽提提后后用用乙乙醇醇沉沉淀淀水水相相中中的的DNADNA。组份组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液q SDSSDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNADNA溶液溶液基因组基因组DNADNA其它方法其它方法物理方式：玻璃珠法、物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、超声波法、研磨法、冻融法冻融法化学方式化学方式：

36、异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：吸附材料结合法：吸附材料结合法：q根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，

37、从而达到分离目的。浓盐法：浓盐法：有机溶剂抽提法有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNPRNP和和DNPDNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法q碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状

38、分子；为共价闭合环状分子；当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其天然构象；时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。q碱裂解法流程图碱裂解法流程图对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬

39、充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液质粒质粒DNADNA煮沸法煮沸法q煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分线状分子，而质粒子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，共容易发生变性，共价闭环的质粒价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA

40、片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。细胞器细胞器DNADNA差速离心法差速离心法q差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以

41、分离。从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留

42、有金属离子子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）DNADNA提取常见问题提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原因原因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADN

43、A被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲

44、液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 原因原因1.1.实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分3.3.沉淀不完全沉淀不完全4.4.洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失1.1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.2.动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物酶或菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁机械方式破壁3.3.高温裂解时，时间适当延长高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加（对于动物细胞、细菌可增加PKPK的用量）的用量）4.4.低温

45、沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间5.5.加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀6.6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒吸出，勿倾倒q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策 原因原因q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 原理：原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；性，核酸释放；释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分别位于整个体下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分

46、离系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNARNA。RNARNA提取的通用方法提取的通用方法q异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 步骤步骤:材料准备：材料准备：尽量新鲜。尽量新鲜。裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑制核酸酶。有效抑制核酸酶。纯化分离：纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。氯仿可抽提去除杂物。洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇

47、。沉淀：沉淀：异丙醇、无水乙醇。异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（乙酸钠（pH4.0pH4.0）：）：维持变性的细胞裂解液的维持变性的细胞裂解液的pHpH值，沉淀值，沉淀RNARNA。此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。RNARNA提取的通用方法提取的通用方法q 材料材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在存在TRIzolTRIzol或或样品贮存液中，于样品贮存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，请分成多份保存如要多次提取

48、，请分成多份保存液氮长期保存，液氮长期保存，7070短期保存短期保存影响影响RNARNA提取的因素提取的因素q 样品破碎及裂解样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：酵母和细菌：一般一般TRIzolTRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁酶或者机械方法破壁动植物组织：动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂

49、解样品量适当，保证充分裂解为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的用量污染，可适当加大裂解液的用量影响影响RNARNA提取的因素提取的因素q 纯化：纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiClLiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成造成 RNA RNA 降解；降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA RNA 后续酶反后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。应的杂质，是目前较为理

50、想的选择。影响影响RNARNA提取的因素提取的因素RNARNA提取常见问题提取常见问题q RNA RNA 的降解的降解 q ODOD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳RNARNA降解降解q 新鲜细胞或组织新鲜细胞或组织：裂解液的质量裂解液的质量外源外源RNaseRNase的污染的污染裂解液的用量不足裂解液的用量不足组织裂解不充分组织裂解不充分另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 (如如脾脾脏脏，胸胸腺腺等等)，很很难避免难避免 RNA RNA 的降解。的降解。建建议议在在液液氮氮条条件件下下将将组组