GFP绿色荧光蛋白.ppt

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1、绿色荧光蛋白在抗肿瘤药物研究中的应用概述l1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(AequoreaVictoria)中分离出了GFP(Green-FluorescentProtein)。l1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。l1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。l之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。GFP的发光特性lGFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱

2、最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。lGFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似,因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合同样适用于GFP观察。l尽管450490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测。GFP的性质lGFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450490nm蓝光波长下更稳定。lGFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立

3、即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。lGFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。l但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。l由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。ComparisonofGFPandLuciferaseImagingMethodMinimumcellsimageableinvitr

4、oMinimumcellsimageableinvivoNeedforsubstrate?Needforanesthesia?MethodofvisualizationMulticolorimagingGFP11NoNoDirectImagingYesLuciferase3003000YesYesPhotoncounting(pseudo-color)NoGFP在生物医学中的应用lGFP作为新型报告基因用于转基因研究lGFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用l研究活细胞分子变化过程l发育分子机理研究l示踪病原菌l临床检验l在肿瘤研究中的应用GFP在肿瘤研究中的应用lGFP在肿瘤发病机制

5、研究中的应用lGFP在肿瘤发生发展研究中的应用lGFP在检测肿瘤血管形成方面的应用lFP在抗肿瘤药物筛选中的应用GFP在肿瘤发病机制研究中的应用lGFP是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。l在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞

6、凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,若过表达,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因。l肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。GFP在肿瘤发生发展研究中的应用l研究肿瘤生长、浸润和转移的传统方法是将载瘤动物分阶段处死,做成光学或免疫组化切片进行观察,或采用CT、ECT、MRI、PET等影像仪器进行检测。为了详细了解肿瘤的生物学行为特征,即使使用大量的动物和昂贵的设备,也难以对肿瘤

7、细胞的生长、瘤体形成过程进行连续、动态的观察。l曾有报道将标记了荧光染料的肿瘤细胞经血管注射到动物体内,研究转移病灶形成过程,但由于标记后肿瘤细胞的荧光信号很易衰减,加上肿瘤细胞分裂,通常23d后便难以显示或跟踪经荧光标记过的肿瘤细胞。为了克服上述缺陷,Yang等建立了一种在活体内可连续、重复、动态观察肿瘤细胞生长及瘤体形成过程的方法。lExternalwhole-bodyimagesoftheBxPC-3-GFPprimarytumorcomparedwithinternalimages.A,fluorescentimagesoftheprimarypancreatictumor(P),om

8、ental(O),bowel(B),andspleen(S)metastases.B,animageofthesamemouseafterlaparotomyinternallylocalizedtheexternalimagesofmetastatictumors.l初步经验显示,荧光的强弱与肿瘤大小、深度有关,肿瘤位于皮下0.5mm时,可检测到的最小瘤灶为59m;距皮下2.2mm时,能够检测到的瘤体约为1.8mm;深在部位的肿瘤,其所发出的荧光由于受周围组织,尤其是皮肤的干扰,小的瘤灶常难以显示。l为此,Yang等在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣,观察时打开皮瓣,建立一条荧光通路,大大提高

9、了检测的敏感性,从而可检测出脑内、肝内单个肿瘤细胞,以及由数个肿瘤细胞形成的肺内微小瘤灶。BladdercancermodelsFeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsiteslymphnodesliverlungpancreasspleendiaphragmomentumKU-7-GFPhumanbladdercarcinomagrowingonnudemousebladder近年来，随着研究的进一步深入，有越来越多的模型用于研究。HumanU-87-RFPgliomagrowinginbrainofnudemous

10、e.Whole-bodyimage.BraincancermodelsFeaturesOrthotopictransplantationGreenFluorescentProteinexpressionRedFluorescentProteinexpressionlOrthotopictransplantationofintacttissuelMetastaticsiteslymphnodesliverlungskeletonlEstrogen-dependentlEstrogen-independentlGreenFluorescentProteinexpressionlRedFluores

11、centProteinexpressionMX-1-GFPandRFPbreastcarcinomagrowingonmammaryfatpadsofSCIDmouse.Whole-bodyimage.BreastcancermodelsFeaturesHumanLOX-1-GFPmelanomametastasizedtolung(A),lympnode(B),bone(C)andadrenalgland(D)ofnudemouse.MelanomamodelsFeatureslOrthotopictransplantationofintacttissuelMetastaticsitesly

12、mphnodeslungskeletonbrainkidneyadrenalglandsLungcancermodelsFeatureslOrthotopictransplantationofintacttissuelMetastaticsiteslymphnodescontralaterallungkidneyskeletonesophagusdiaphragmbrainheartlSmall-CellCarcinomalNon-SmallCellCarcinomalAdenocarcinomalGreenFluorescentProteinexpressionPC-3humancarcin

13、omagrowingonprostateandmetastasizedtonumerouslymphnodesofnudemouse.Whole-bodyimage.ProstatecancermodelsFeatureslOrthotopictransplantationofintacttissuelMetastaticsiteslymphnodesliverlungskeletonlGreenFluorescentProteinexpressionlRedFluorescentProteinexpressionNUGC-4-GFPhumanstomachtumorinnudemouse.P

14、rimarytumor-redarrow,lymphnodemetastases-whitearrowsStomachcancermodelsFeatureslOrthotopictransplantationofintacttissuelMetastaticsiteslymphnodesliverlungpancreasadrenalglandkidneyperitoneumlGreenFluorescentProteinexpressionSkull(a)andrib(b)metastasesofPC-3-GFPhumanprostatecarcinomagrowingorthotopic

15、allyinnudemouse.SkeletalmetastasisofB16-GFPmousemelanomainnudemouseSkeletalmetastasesofH460-GFPhumanlungcancerorthotopicallygrowinginnudemousetibia(a),skull(b)andfemur(c)BonemetastasesGFP在检测肿瘤血管形成方面的应用l肿瘤血管形成是肿瘤生长、浸润和转移的必备条件,如果没有新生血管供应营养,肿瘤达到12mm的直径将不再增大。因此,测定肿瘤内微血管密度(microvesseldentisity,MVD),可以判断患者预后,通常测定MVD的方法是以抗血管内皮细胞抗体显示血管,计数阳性染色的新生血管数目。由于切片固定和脱水过程中可出现组织体积和形状的改变,采用免疫组化法获得的MVD值可靠性较差GFP在抗肿瘤药物筛选中的应用lGFP作为一种报告基因,转染肿瘤细胞后,将随着肿瘤细胞的分裂、生长而传给下代,也将随着肿瘤细胞的死亡而消亡。根据这一特性,人们已将GFP应用于抗癌药物的疗效评价、肿瘤耐药机制的研究。lChambers等将GFP转染卵巢癌细胞SKOV3,在筛选出的阳性细胞内加入抗癌药物阿霉素,结果大部分肿瘤细胞荧光消失,并且证实失去荧光的肿瘤细胞均已死亡。随后的体内实验结果也与体外实验一致