第二章色谱法导论PPT讲稿.ppt
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1、第二章色谱法导论第二章色谱法导论第1页,共78页,编辑于2022年,星期二第一节第一节 概述概述1、色谱法的概念、色谱法的概念概念概念色谱法又称色层法、层析法,是用于多组分有机混合物的一种高效分离技术。特点特点选择性好、分离效能高、灵敏度高、分析速度快等优点。先进性先进性 已逐步实现仪器化、自动化、高速化,并从分离手段发展到分析手段,应用范围不断扩大,分离的对象早已不限于有色物质,但“色谱法”这一名称一直被沿用。范围范围色谱法与现代新检测技术和计算机技术相结合,已广泛食品质量与安全等的有关工作,如样品中农药残留量的测定、农副产品分析、食品质量检验、生物制品的分离制备等。第2页,共78页,编辑于
2、2022年,星期二2、色谱法的起源、色谱法的起源1906年,俄国植物学家茨维特首创了这种分离技术,他把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中,再加入纯石油醚,任其自由流下,原混合物开始被分离成不同颜色的谱带(色素的分离),且以不同速度通过子,然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。茨维特把这种分离结果称为色谱图,把这种分离方法命名为色谱法(chromatography)。此后,出现了种类繁多的各种色谱法。第3页,共78页,编辑于2022年,星期二3、色谱法的本质、色谱法的本质色谱法共同的基本特点是具备两个相:不不动动的的一一相相,称称为为固固定定相相;另一相是携带样品流
3、过固定相的流动体,称为流动相另一相是携带样品流过固定相的流动体,称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在在性性质质和和结结构构上上的的差差异异,与固定相相相互互作作用用的的类类型型、强强弱弱也也有有差差异异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞滞留留时时间间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱法是基于混合物各组分在两相色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相固定相和流动相)之间之间的不均匀分配进行分离的一种方法。的不均匀分配进行分离的一种方法。目前色谱法已广泛应用于许多领域,成为十分重要的分离分析手段。许多气体、液体和固体样品
4、都能找到合适的色谱法进行分离和分析。第4页,共78页,编辑于2022年,星期二Temporal course色谱分离色谱分离淋洗液淋洗液慢慢中等中等快快第5页,共78页,编辑于2022年,星期二4、色谱法的分类、色谱法的分类(1)按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱(GC),气固色谱(GSC)固定相是固体吸附剂;气液色谱(GLC)固定相是固定液(附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体)。液体为流动相的色谱称液相色谱(LC),液固色谱(LSC);液液色谱(LLC)。超临界流体超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱(SFC)。随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种
5、化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱(CBPC)。第6页,共78页,编辑于2022年,星期二第7页,共78页,编辑于2022年,星期二(2)按分离机理分类l吸附色谱法:利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。l分配色谱法:利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法。l离子交换色谱法:利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法。l凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法:利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法。l亲和色谱法:最近,又有一种新分离技术,利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的技术,常用于蛋白质的分
6、离。第8页,共78页,编辑于2022年,星期二a.吸附色谱法原原理理:被分离物与吸附剂表面分子相互作用而被吸附,由于不同化合物结构及性质上的差异,在吸附剂上的吸附性能是不同的,在色谱分离过程中,用一定的溶剂系统洗脱柱子时,由于溶剂(洗脱剂)与混合物里各组分争夺吸附剂的活性表面,解吸出来的组分与溶剂始终存在着对吸附剂的竞争吸附,洗脱剂对不同的物质的洗脱能力也是不同的。特特点点:因此吸附与解吸始终贯穿整个色谱过程,吸附与解吸是吸附色谱法的理论基础。吸附过程无选择性,吸附与解吸附过程可逆,但吸附强弱和先后顺序都基本遵循“相似相吸附”的经验规律。吸附力最弱的组分随溶剂首先流出。常用极性吸附剂常用极性吸
7、附剂:硅胶、氧化铝、聚酰胺。第9页,共78页,编辑于2022年,星期二第10页,共78页,编辑于2022年,星期二b.分配色谱原理原理:将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等载体上作为固定相,再用与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流动相,物质可在两相溶剂相对做逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。分类分类:正相色谱:固定相采用强极性溶剂,如水、缓冲溶液等,流动相则用氯仿等弱极性溶剂,称之为正相(normalphase)色谱;反相色谱:以弱极性成分如石蜡油为固定相,流动相则以水、乙腈、甲醇强极性溶剂,则两相可以颠倒,称之为反相(reversephase)色谱,更适合于水溶性成分的分离。液液分配色谱的分
8、离条件可以基于相应的正相及反相分配薄层层析结果加以选定。第11页,共78页,编辑于2022年,星期二c.离子交换色谱原理原理:以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固体颗粒为固定相,装在柱中,以水或含水溶剂为流动相,使样品溶液流过交换柱,溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂可交换基团相反电荷的离子通过柱子从柱底流出,而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上。规律:规律:由于不同离子与同一树脂交换能力不同,移动速度也不同,在柱上形成色谱带,另选一适当的洗脱剂(含有比吸附物质更活泼的离子)进行洗脱交换,可将吸附物质按先后顺序从柱上洗脱下来,即可实现不同组分物质的分离。
9、范围:范围:主要用于分离氨基酸,生物碱,糖类化合物。第12页,共78页,编辑于2022年,星期二d.凝胶色谱法原理原理:也叫分子筛过滤,利用分子筛分离物质的一种方法。所用载体,如葡聚糖凝胶,是不溶于水,但可在水中膨胀的球形颗粒,具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后装入层析柱中。加入样品,用同一溶剂洗脱时,由于凝胶网孔半径的限制,大分子将不能渗入凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶颗粒外部),所以在颗粒间隙移动,并随溶剂一起从柱底先流出,小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部,故通过层析柱时阻力增大、流速变缓,较晚流出。分类分类:(1)葡聚糖凝胶(2)羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)
10、。第13页,共78页,编辑于2022年,星期二过程过程:样品混合物中各个成分因分子大小各异,渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同,故在经历一段时间流动并达到动态平衡,即按分子由大到小次序先后流出并得到分离。第14页,共78页,编辑于2022年,星期二e.亲和色谱第15页,共78页,编辑于2022年,星期二(3)按固定相的外形分类固定相装于柱内的色谱法,称为柱色谱柱色谱。固定相呈平板状的色谱法,称为平板色谱平板色谱,它又可分为薄层色谱和纸色谱。根据以上所述,将色谱法的分类总结于下表中。第16页,共78页,编辑于2022年,星期二第17页,共78页,编辑于2022年,星期二第二节第二节 色谱流出曲线
11、及有关术语色谱流出曲线及有关术语1、色谱流出曲线和色谱峰样品各组分在色谱柱中得到分离后随流动相依次流出色谱柱,先后到达检测器。经检测器把各组分的浓度信号转变成电信号,然后用记录仪或工作站软件将组分的信号记录下来,这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为色谱流出曲线,也叫做色谱图。第18页,共78页,编辑于2022年,星期二色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰,由于响应信号的大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比,色谱流出曲线实际上是物质的量或浓度时间曲线。第19页,共78页,编辑于2022年,星期二l如果进样量很小,浓度很低,在吸附等温线的线性范围内,色谱峰如果对称,可用Gauss正态分
12、布函数表示:l式中:C不同时间t时某物质在柱出口处的浓度,C0进样浓度,tr保留时间,标准偏差。第20页,共78页,编辑于2022年,星期二2、基线在实验操作条件下,柱中仅有流动相通过时,检测器响应讯号的记录值,即图中O-t线。它应该是一条直线,若是斜线就称为基线漂移,如果基线出现上下波动则称为噪声。保持基线平稳,是进行色谱分析的最基本要求。3、峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以h表示,如图中BA。是色谱定量分析的依据之一。第21页,共78页,编辑于2022年,星期二4、保留值(retentionvalue)(1)死时间tm不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰极大值所需的
13、时间称为死时间,它正比于色谱柱的空隙体积,如图中OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解,故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时,可用往长L与tm的比值计算。第22页,共78页,编辑于2022年,星期二(2)保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间,称为保留时间,如图中的OB它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间第23页,共78页,编辑于2022年,星期二(3)调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间,即tR=tR-tm由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间,所以tR实
14、际上是组份在固定相中停留的总时间。保留时间是色谱法定性的基本依据,但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响,因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定第24页,共78页,编辑于2022年,星期二(4)死体积Vm指色谱柱在填充后,柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时,死体积可由死时间与流动相体积流速F0(mLmin)计算:Vm=tmF0(5)保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积的关系:VR=tRF0第25页,共78页,编辑于2022年,星期二(6)调整保留体积
15、VR某组分的保留体积扣除死体积后,为该组分的调整保留体积VR=VR-Vm(7)相对保留值r2.1某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比,称为相对保留值:由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,因此,它是色谱法中,特别是气相色谱法中,广泛使用的定性数据。必须注意,相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比必须注意,相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比。第26页,共78页,编辑于2022年,星期二5、选择因子在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时,ri/s可能大于1,也可能小
16、于1。在多元混合物分析中,通常选择一对最难分离的物质对,将它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下,可用符号表示:式中,tr(i)为后出峰的调整保留时间,所以这时总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标,又称选择因子。第27页,共78页,编辑于2022年,星期二6、区域宽度色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数,它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法:a.a.标准偏差标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半,如图中EF距离的一半。b.b.半峰宽半峰宽WW1/21/2即峰高一半处对应的峰宽,如图中GH间的距离它与标准偏差的关系是:W1
17、/2=2.354c.c.峰底宽度峰底宽度WW即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距,如图中IJ的距离。它与标准偏差的关系是:W=4在相同的色谱操作条件下获得色谱峰的区域宽度值越小,说明色谱柱的分离效能越好,柱效越高。第28页,共78页,编辑于2022年,星期二7.峰面积由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积,用“A”表示,是色谱定量分析的基本依据,对理想的对称峰,峰面积与峰高,半峰宽的关系为A=1.065hW1/2。第29页,共78页,编辑于2022年,星期二一组分的色谱流出曲线对色谱分析十分重要,从色谱图上可以获得以下信息:(l)根据色谱峰的个数,可以判断样品中所合组份的最少个数。(2)根
18、据色谱峰的保留值(或位置),可以进行定性分析。(3)根据色谱峰下的面积或峰高,可以进行定量分析。(4)色谱峰的保留值及其区域宽度,是评价色谱柱分离效能的依据。(5)色谱峰两峰间的距离,是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。第30页,共78页,编辑于2022年,星期二第三节第三节 色谱法基本原理色谱法基本原理l色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。l组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质有关。有关。两组分分配系数相差越大,两色谱峰间的距离就越大
19、。l但是两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽,以致彼此重叠,还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。l因此,要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。色谱分析的基本理论有两个:一个是以热力学平衡为基础的塔板理论;另一个是以动力学为基础的速率理论,两个理论相辅相成,较为满意地揭示了色谱分析中的有关问题和现象。第31页,共78页,编辑于2022年,星期二1、分配系数K和分配比k(1)分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程,
20、而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述,而描述这种分配的参数称为分配系数K。它是指在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,即分配系数是由组分和两相的热力学性质决定的。第32页,共78页,编辑于2022年,星期二例:逆流分配色谱l取一系列试管,向1号管加入互不相溶的两种溶剂,A溶剂为上相(动相),B溶剂为下相(静相),体积相等。l加入物质Y(K=1)和物质Z(K=1/3)的混合物,各组分物质将按自己的分配系数在上下相中进行分配。l平衡后,将上相转移到2号管内,其中含有相同体积的新下相,从1号转移来的样品将在2号
21、管的上下相中再分配。l与此同时,向1号管内加入新的上相,这里也将发生样品的再分配。第33页,共78页,编辑于2022年,星期二第34页,共78页,编辑于2022年,星期二第35页,共78页,编辑于2022年,星期二分配系数小的物质Z沿一系列分溶管的“移动”速度比分配系数大的物质Y快。那么它流出色谱柱。每一种物质在一系列分溶管中是相当集中的,分溶曲线呈峰形,只要使用足够数目的分溶管,继续进行分配,就可以使两峰彼此分来。一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时,转移次数越多,即分溶管数越多,其分溶曲线越集中,即峰形窄而高,有利于各物质的完全分离。第36页,共78页,编辑于2022年,星期二(2)
22、分配比k分配比又称容量因子,它是指在一定温度和压力下,组分在两相间分配达平衡时,分配在固定相和流动相中的质量比。即 k值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大,因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化,而且还与流动相及固定相的体积有关。第37页,共78页,编辑于2022年,星期二滞留因子Rs分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u,组分在柱内线速度为us,由于固定相对组分有保留作用,所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。它反映了组分在流动相中的分配比例数。例如,某组分
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