2020版药典微生物变更细则.ppt

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1、新版药典变更解读新版药典变更解读 微生物相关微生物相关分析质检中心微生物组分析质检中心微生物组20202020年年0505月月涉及内容涉及内容药典三部：生物制品通则：生物制品生产检定用菌毒种管理规程总论：微生态活菌制品总论（变更）通则1101 无菌检查法（变更）1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法1107 非无菌药品微生物限度标准3605 细菌生化反应培养基1421 灭菌法 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则9203 药品微生物实验室质量管理指导原则9204 微生物鉴定指导原则（变更）9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指

2、导原则（变更）通则新增新增灭菌用生物指示剂指导原则（新增）生物指示剂耐受性检查法指导原则（新增）细菌 DNA 特征序列鉴定法（新增）一、生物制品生产检定用菌毒种管理规程一、生物制品生产检定用菌毒种管理规程菌毒种，系指直接用于制造和检定生物制品的细菌、支原体、立克次体或病毒等生产和检定用菌毒种，来源途径应合法，并经国务院药品监督管理部门批准。微生物检测用菌来源：CMCC:中国医学细菌保藏管理中心CICC:中国工业微生物菌种保藏管理中心ATCC:美国微生物菌株保藏中心生物制品生产用菌毒种应采用种子批系统。每批主种子批和工作种子批均应按各论要求保管、检定和使用。菌毒种的传代及检定实验室应符合国家生物

3、安全的相关规定。各生产单位质量管理部门对本单位的菌毒种施行统一管理。保管菌毒种应有严格的登记制度，建立详细的总账及分类账。收到菌毒种后应立即进行编号登记，详细记录菌毒种的学名、株名、历史、来源、特性、用途、批号、传代冻干日期和数量。在保管过程中，凡传代、冻干及分发，记录均应清晰，可追溯，并定期核对库存数量。收到菌毒种后一般应及时进行检定。用培养基保存的菌种应立即检定生产用菌毒种应按各论要求进行检定销毁四类菌毒种须经单位领导批准。销毁后应在账上注销，作出专项记录，写明销毁原因、方式和日期。二、微生态活菌制品总论二、微生态活菌制品总论微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成，无论在生产过程、制品贮存

4、和使用期间均应保持稳定的活菌状态。它可由一株、多株或几种细菌制成单价或多价联合制剂。根据其不同的使用途径和方法可制备成片剂、胶囊颗粒剂或散剂等多种剂型。基本要求基本要求：微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量，保持其稳定性，同时应防止外源因子的污染。生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。生产用菌种生产用菌种生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定名称及来源；种子批的建立：三级种子批应分别冻干，置适宜温度保存；种子批传代应限定传代次数，原始种子批和主种子批启开后传代次数不得超过10代，工作种子批启开后至发酵培养传代次

5、数不得超过5代。生产用菌种生产用菌种种子批的检定：应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌命名手册的有关规定进行，形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。三级种子批常规检查包括以下3 项：（1）培养特性及染色镜检；（2）生化反应；（3）毒性试验原始种子或主种子批还需进行以下检查（1）细菌代谢产物脂肪酸测定 （2）遗传特性分析 （3）抗生素敏感性试验 （4）稳定性试验 生产用菌种生产用菌种原始种子和主种子应冻干保存于8以下，工作种子应置于适宜温度保存检定检定微生态活菌制品质量检定应包括菌粉检定、半成品检定和成品检定 菌粉检定菌粉检定1.外观2.目的菌检查

6、 取少量菌粉加入适量灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液后，涂布在适宜琼脂平皿上，在适宜条件下培养，其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。3.杂菌检查 方法和结果判断见本总论附录3。如不符合规定应废弃。4.干燥失重5.活菌数测定 测定每克菌粉中含有的活菌数量。方法见本总论附录2。半成品的检定半成品的检定半成品须做杂菌检查，根据用药途径确定杂菌检查的质控指标。方法和结果判断见本总论附录3。成品检定成品检定1.鉴别试验 检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“种子批的检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。2.理化检查3.活菌数测定 按本总论附

7、录2方法测定每克制品中的活菌数，应符合规定。多价制品应分别测定各单价活菌数。4.杂菌检查 方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。5.安全试验（新版已删除新版已删除）附录附录2 微生态活菌制品活菌数测定法微生态活菌制品活菌数测定法无菌称取3.0g制品或菌粉（胶囊取内容物），加入27.0ml稀释液中，充分摇匀，做10倍系列稀释（最终稀释度根据不同的指标要求而定）。取最终稀释度的菌液100l，滴入选择性琼脂培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。活菌数（CFU/g）=3

8、个平皿菌落数之和/3*10*最终稀释度附录附录3 微生态活菌制品杂菌检查法微生态活菌制品杂菌检查法微生态活菌制品杂菌检查法系检查微生态活菌制品的菌粉、半成品及成品受外源微生物污染程度的方法。检查项目包括控制菌检查，非致病性杂菌、真菌计数。变更变更：附录附录3 微生态活菌制品杂菌检查法微生态活菌制品杂菌检查法新增：由于供试品本身含有大量活菌，可能在杂菌检查所用的培养基上生长，干扰杂菌回收或结果判断，在建立或修订方法时应考虑其适用性，充分了解供试品活菌在杂菌检查培养基上的生长特性。除本附录收载的杂菌检查用培养基之外，亦可采用其他经验证的培养基。附录附录3 微生态活菌制品杂菌检查法微生态活菌制品杂菌

9、检查法新增：如果供试品本身对某些试验菌具有较强的抑菌性能，影响试验菌的回收。在此情况下，应根据原辅料的杂菌负载、生产工艺及产品特性进行风险评估，保证检验方法的可靠性；在药品生产、贮藏各个环节中，应严格遵循GMP的指导原则，以降低产品受杂菌污染的风险。附录附录3 微生态活菌制品杂菌检查法微生态活菌制品杂菌检查法新增：控制菌检查法检出意思致病菌时，可参考“微生物鉴定指导原则（通则9204）”的提示进行后续确证，确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法。检验量及供试品的准备检验量及供试品的准备检验量，即一次试验所用的供试品量（g）。检验时，应从2个以上最小包装单位中随机抽取不少于3倍检验用量的供试品。

10、菌粉、半成品以及成品为散剂和颗粒剂的可直接称取备用；成品为片剂、胶囊剂的需研碎后备用。供试品检查阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。取阳性对照菌于相应选择性培养基平皿上划线接种，按供试品的控制菌检查方法培养，观察菌落生长情况。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验 取增菌液0.1ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。控制菌检查控制菌检查100l大肠埃希氏菌；志贺菌、沙门菌；铜绿假单胞菌；金黄色葡萄球菌；梭菌；白色念珠菌；变更：大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌志贺菌、沙门菌志贺菌、沙门菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌增加：若平皿上未见菌落生长，或虽有菌落生长

11、但鉴定结果为非控制菌，判供试品未检出铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌删除：绿脓菌素试验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌删除：血浆凝固酶试验控制菌检查用培养基的适用性检查变更:非致病性杂菌、真菌计数非致病性杂菌、真菌计数阳性对照阳性对照除另有规定外，真菌以白色念珠菌为对照菌，其他以金黄色葡萄球菌为对照菌变更为：当采用营养琼脂培养基或玫瑰红纳琼脂培养基进行检查时，真菌计数以白色念珠菌为对照菌，非致病杂菌计数以金黄色葡萄球菌为对照菌因供试品为活菌制品，应选用能抑制目的菌生长的选择性培养基进行检查。除另有规定外，营养琼脂培养基用于非致病性杂菌的计数，玫瑰红钠琼脂培养基用于真菌计数。排除目的菌干扰的也可

12、采用其它经验证的培养基真菌计数真菌计数称取供试品1g，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液或其他适宜稀释液中，混匀，做10倍系列稀释，取适宜稀释度供试品溶液0.1ml加到已备好的玫瑰红钠琼脂培养基上，以玻棒涂匀，一式3份，倒置，于恒温培养箱中培养96小时，每天观察结果，记录平皿上生长的真菌菌落数.结果计算：以3个平皿上生长的菌落平均数计算。真菌数（真菌数（CFU/g）=3个平皿菌落数之和个平皿菌落数之和/3*10*稀释倍数稀释倍数计数培养基的适用性检查变更:增加：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）、沙门、志贺菌属琼脂培养基（SS）三、三、920

13、4 微生物鉴定指导原则微生物鉴定指导原则（变更）（变更）本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、中间体中间产品、终产品和环境等中检出微生物的鉴定提供指导。当微生物的鉴定结果有争议时，以伯杰氏系统细菌学手册现行版的鉴定结果为准。微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，对所检出微生物的常规特征包括菌落形态学、细胞形态学（杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等）、革兰染色或其它染色法、及某些能够给出鉴定结论的关键生化反应（如氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应）进行分析，一般即可满足需要

14、；非无菌产品的控制菌检查一般应达到种属药典规定的水平；无菌试验结果阳性和、无菌生产模拟工艺（如培养基灌装）失败、环境严重异常事件时，对检出的微生物鉴定至少达到种属水平，必要时需达到菌株水平微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到的鉴定水平选择鉴定方法。未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准参考微生物（模式菌株、标准菌株或经确认的菌株等）的特征（基因型和/或表型）相匹配来完成在日常的微生物鉴定试验中，用户应明确所采用鉴定系统的局限性及所要达到的鉴定水平（属、种、菌株），选用最适合要求的鉴定技术，必要

15、时采用多种鉴定方法确定。待检菌的分离纯化待检菌的分离纯化最常用的分离纯化方法是挑取待检菌在适宜的固体培养基上连续划线分离纯化，以获取待检菌的纯培养物（单个菌落）,必要时可进一步进行纯培养，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量菌体。初筛试验初筛试验常见的初筛试验包括形态观察、革兰染色、芽孢染色、镜检（或氢氧化钾拉丝试验）、观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。氧化酶试验氧化酶试验 用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）。过氧化氢酶试验过氧化氢酶试验 用于区分葡萄球菌（过氧化氢酶阳性）和链球菌（过氧化氢酶阴性）。凝固酶试验凝固酶试验 用于区分凝固酶阴性葡萄球菌（可推测

16、为非致病性）和凝固酶阳性葡萄球菌（很可能为致病性）。表型微生物鉴定表型微生物鉴定表型微生物鉴定表型微生物鉴定除受其遗传基因的控制外，还与微生物的分离环境、培养基和生长条件等因素有关在表型鉴定时应注意采用的培养基、培养时间和传代次数对鉴定结果的影响四、四、3605 细菌生化反应培养基细菌生化反应培养基测定细菌的糖类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、碳源和氮源利用试验等生化反应糖、醇发酵培养基七叶苷培养基磷酸盐葡萄糖胨水培养基（MR-VP反应）蛋白胨水培养基（靛基质试验）三糖铁琼脂培养基克氏双糖铁琼脂培养基脲（尿素）培养基苯丙氨酸琼脂培养基氨基酸脱羧酶试验培养基明胶培养基丙二酸钠培养基枸橼酸盐培养

17、基硝酸盐胨水培养基石蕊牛奶培养基半固体营养琼脂培养基五、细菌五、细菌 DNA 特征序列鉴定法（新增）特征序列鉴定法（新增）细菌 DNA 特征序列鉴定法系以特征核酸序列作为目标检测物，用于药用原料、辅料、制药用水、中间产品、终产品、包装材料和环境等药品全生命周期质量控制中细菌的鉴定。开展细菌鉴定试验的环境应具备分子生物学实验室的基本条件，并符合相应级别的生物安全要求。六、六、1101 无菌检查法（变更）无菌检查法（变更）培养基的变更：制备好的培养基应保存在 225、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在 3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不

18、得超过培养基深度的1/53，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过 20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。培养基的适用性检查培养基的适用性检查无菌性检查无菌性检查 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），置各培养基规定的温度培养 14 天，应无菌生长。灵敏度检查灵敏度检查菌液制备：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养 1824 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养 23 天 2448 小时，

19、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025培养 57 天，加入 35ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。培养接种培养接种取每管装量为 12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基 7 支，分别接种小于不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培养不超过 3 天；取每管装量为 9ml 的胰酪大豆胨液体培养基 7 支,分别接种小于不大于 100cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培养不超过 5

20、 天。逐日观察结果。结果判定结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定薄膜过滤法薄膜过滤法薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。无菌检查用的滤膜孔径应不大于 0.45m。滤膜直径约为 50mm，若使用其他尺寸的滤膜，应对稀释液和冲洗液体积进行调整,并重新验证。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性液体供试品水溶性液体供试品水溶性供试液过滤前应先将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。取规定量，直接过滤，或混合至含不少于 100ml 适宜稀释液的无菌容器中，混匀，立即过滤。七、七、9202 非无菌产品微生物限度检

21、查指导非无菌产品微生物限度检查指导原则原则为更好应用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）、非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）及非无菌药品微生物限度标准（通则1107），特制定本指导原则供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法应尽量选择微生物计数方法中操作简便、快速的方法，同时，所选用的方法应避免损伤供试品中污染的微生物。对照培养基由中国食品药品检定研究院研制及分发。控制菌检查法没有规定进一步确证疑似致病菌的方法。若供试品检出疑似致病菌，确证的方法应选择已被认可的菌种鉴定方法，如细菌鉴定一般依据伯杰氏系统细菌学手册。药品微生物

22、限度标准中，药用原料、辅料及中药提取物仅规定检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。因此，在制定其微生物限度标准时，应根据原辅料的微生物污染特性、用途、相应制剂的生产工艺及特性等因素，还需控制具有潜在危害的致病菌。八、八、1105 非无菌产品微生物限度检查：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法微生物计数法微生物计数法系用于能在有氧条件有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。微生物计数试

23、验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。计数方法计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN法。MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。

24、供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。供试品检查供试品检查检验量：一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。阴性对照试验 以稀释液代替供试液进行阴性对照

25、试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。结果判断结果判断需氧菌总数需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。九、九、1106 非无菌产品微生物限度检查：非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查

26、检查供试品中是否存在特定的微生物供试品中是否存在特定的微生物。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。供试品检查供试品检查供试品的控制菌检查应按经方法适用性试验确认的方法进行。阳性对照试验阳性对照试验 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验阴性对照试验 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。检验项目检验项目 耐胆

27、盐革兰阴性菌（Bile-Tblerant Gram-Negative Bacteria）大肠埃希菌（Escherichia coli）沙门菌（Salmonella）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（Candida albicans）十、十、1107 非无菌药品微生物限度标准非无菌药品微生物限度标准十一、1421 灭菌法灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去，从而使物品残存活微生物的概率下降至预期的无菌保证水平的方法。本法适用于制剂、原料、辅料及医疗

28、器械等物品的灭菌。对于任何一批灭菌物品而言，绝对无菌既无法保证也无法用试验来证实。一批物品的无菌特性只能相对地通过物品中活微生物的概率低至某个可接受的水平来表述，即无菌无菌保证水平保证水平（sterility assurance level，简称 SAL）。实际生产过程中，灭菌是指将物品中污染微生物的概率下降至预期的无菌保证水平。最终灭菌的物品微生物存活概率，即无菌保证水平不得高于10-6。灭菌物品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的无菌保证体系湿热灭菌法湿热灭菌法该法灭菌能力强，为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。湿热

29、灭菌条件的选择应考虑被灭菌物品的热稳定性、热穿透力、微生物污染程度等因素。湿热灭菌条件通常采用12115min、12130min或11640min的程序，也可采用其他温度和时间参数，但无论采用何种灭菌温度和时间参数，都必须证明所采用的灭菌工艺和监控措施在日常运行过程中能确保物品灭菌后的SAL10-6。对热稳定的物品，灭菌工艺可首选过度杀灭法，以保证被灭菌物品获得足够的无菌保证值。采用湿热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂进一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。本法常用的生物指示剂为嗜热

30、脂肪芽孢杆菌孢子湿热灭菌法湿热灭菌法干热灭菌法干热灭菌法干热灭菌条件一般为（160170）120min以上、（170180）60min以上或25045min以上，也可采用其他温度和时间参数。无论采用何种灭菌条件，均应保证灭菌后的物品的SAL10-6。采用干热过度杀灭后的物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定。25045min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子十二、灭菌用生物指示剂指导原则（新增）十二、灭菌用生物指示剂指导原则（新增）生物指示剂是一种对特定灭菌程序有确定及稳定的耐受性的特殊微生物制成品，可用于灭菌设备的性能确认、特

31、定物品的灭菌工艺研发及建立、产品灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控、灭菌程序的定期再验证、隔离器和无菌洁净室灭菌效果的验证评估等。生物指示剂的分类生物指示剂的分类生物指示剂用微生物的基本要求生物指示剂用微生物的基本要求不同灭菌工艺使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物应具备以下特征：（1）菌种的耐受性应大于需灭菌物品中所有可能污染菌的耐受性。（2）菌种应无致病性。（3）菌株应稳定，存活期长，易于保存。（4）易于培养。生物指示剂的芽胞含量要在 90%以上生物指示剂的制备生物指示剂的制备生物指示剂的应用生物指示剂的应用生物指示剂的性能评估接收商品化生物指示剂时，应进行微生物纯度和形

32、态的鉴定及测定微生物数量。生物指示剂应在有效期内使用，必要时应重新进行耐受性检查。芽胞数范围在 1.0 106至 5.0 106。芽胞数范围在 1.0 106至 5.0 107。芽胞数范围在 1.0 105至 5.0 106用户应科学的选择和使用生物指示剂.在灭菌程序的建立、确定、验证和日常监控中,需对灭菌产品（包括其材料和包装）进行全面了解,确保灭菌参数能达到所需的 SAL 水平。生物指示剂的初始微生物的数量、耐受性（菌体耐受性）和放置的位置、方式等情况都会影响其灭活效果。需通过实验室研究确定产品各组成部分是否比产品内的溶液或药品更难灭菌。根据产品中最难灭菌的部位，制定不同的工艺参数以确保无

33、菌保证水平小于 106。十三、生物指示剂耐受性检查法指导原则十三、生物指示剂耐受性检查法指导原则（新增）（新增）本指导原则用于指导生物指示剂的耐受性以及相关质量参数的测定，也可用于生产过程污染微生物的耐受性测定。总芽胞计数:培养基：胰酪大豆胨液体培养基（芽孢悬液制备）、胰酪大豆胨琼脂培养基（芽孢计数）热激活培养和计数生物指示剂的总芽胞数一般为标示值的 50%300%。十四、十四、9203 药品微生物实验室质量管理指导药品微生物实验室质量管理指导原则原则药品微生物实验室质量管理指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物

34、检验方法的误差较大等。因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室质量管理指导原则要求进行检验。药品微生物实验室质量管理指导原则包括以下几个方面：人员、培养基、试剂、菌种、环境、设备、样品、检验方法、污染废弃物处理、检测结果质量保证和检测过程质量控制、实验记录、结果的判断和检测报告、文件等。1、人员、人员从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景2、培养基、培养基微生物实验室使用的培养基可按处方配制，也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。结块或颜色发生改变的脱水培养基不得使用。脱水培养基应完全溶解于水中，再行分

35、装与灭菌。应确定每批培养基灭菌后的pH值（冷却至室温25测定）。若培养基处方中未列出pH值的范围，除非经验证表明培养基的pH值允许的变化范围很宽，否则，pH值的范围不能超过规定值0.2。自配的培养基应标记名称、批号、配制日期、制备人等信息，并在已验证的条件下贮藏。商品化的成品培养基标签上应标有名称、批号、生产日期、失效期及培养基的有关特性。培养基灭菌后不得贮藏在高压灭菌器中，琼脂培养基不得在0或0以下存放。2、培养基、培养基使用过的培养基（包括失效的培养基）应按照国家污染废物处理相关规定进行实验室配制或商品化的成品培养基的质量依赖于其制备过程，常规监控项目是pH值、适用性检查试验，定期的稳定性

36、检查以确定有效期除药典附录另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行1次。如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。用于环境监控的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中及避免出现假阳性结果。3、试剂、试剂微生物实验室应有试剂接收、检查和贮藏的程序。实验室应标明所有试剂、试液及溶液的名称、制备依据、适用性、浓度、效价、贮藏条件、制备日期、有效期及制备人。4、菌种、菌种药品微生物检验用的试验菌应

37、来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株5、环境、环境微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行环境监测按药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（通则9205）进行所用的消毒剂种类应满足洁净实验室相关要求并定期更换。6、设备、设备仪器设备应有合格证书，实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用，仪器设备使用和日常监控要有记录。7、样品、样品试验样品的采集，应遵循随机抽样的原则，并在受控条件下进行抽样，须采用无菌操作技术进行取样，防止样品受到微生物污

38、染而导致假阳性的结果抽样容器应贴有唯一性的标识，注明样品名称、批号、抽样日期、采样容器、抽样人等如果样品存在数量不足、包装破损、标签缺失、温度不适等，实验室应在决定是否检测或拒绝接受样品之前与相关人员沟通。8、检验方法、检验方法药典方法或标准中规定的方法是经过验证的，当进行样品检验时，应进行方法适用性确认。如果检验方法不是药典或标准中规定的方法，使用前应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典方法。替代方法的验证按药品微生物检验替代方法验证指导原则（通则9201）进行。9、结果的判断和检测报告、结果的判断和检测报告引起微生物污染结果不符合标准的原因主要有两个：试验操作错误或产生无效结

39、果的试验环境条件；产品本身的微生物污染总数超过规定的限度或检出控制菌。异常结果出现时，应进行偏差调查。偏差调查时应考虑实验室环境、抽样区的防护条件、样品在该检验条件下以往检验的情况、样品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情况。如果试验操作被确认是引起实验结果不符合的原因，那么应制定纠正和预防措施，按照正确的操作方案进行实验十五、十五、9205 药品洁净实验室微生物监测和药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则（变更）控制指导原则（变更）本指导原则是用于指导药品微生物检验用的洁净室等受控环境微生物污染情况的监测和控制。本指导原则包括人员要求、初次使用的洁净实验室参数确认、微生物监测方法、监测频次及

40、监测项目、监测标准、警戒限和纠偏限、数据分析及偏差处理、微生物鉴定和微生物控制。确认确认初次使用的洁净实验室应进行参数确认，确认参数包括物理参数、空气悬浮粒子和微生物。药品洁净实验室物理参数的测试应当在微生物监测方案实施之前进行。主要的物理参数包括高效空气过滤器完整性、气流组织、空气流速（平均风速），换气次数、压差、温度和相对湿度等。一般首先在静态下测试，符合要求后再在模拟正常检测条件下进行测试物理参数测试方法参照洁净室施工及验收规范的现行国家标准中附录 D3 高效空气过滤器现场扫描检漏方法、附录 E12 气流的检测、附录 E1 风量和风速的检测、附录 E2 静压差的检测、附录 E5 温湿度的

41、检测进行。初次使用的洁净实验室其空气悬浮粒子和微生物的确认及监测照以下“监测”进行。监测监测药品洁净实验室应定期进行日常监测和定期微生物监测，日常监测一般包括压差、温度、相对湿度等；定期监测应在风险评估的基础上建立洁净环境监测计划。定期监测内容包括物理参数、非生物活性的空气悬浮粒子和有生物活性的微生物监测，其中微生物监测包括环境浮游菌和沉降菌监测，及关键的检测台面、人员操作服表面及 5 指手套等的微生物检测。当微生物监测结果或样品测定结果产生偏离，经评估洁净区可能存在被污染的风险时，应对洁净区进行清洁消毒后重新进行监测悬浮粒子监测悬浮粒子监测增加：悬浮粒子监测方法除取样点的选择和数量、取样量和

42、取样时间外，药品洁净实验室悬浮粒子的监测参考医药工业洁净室（区）浮粒子的测试方法的现行国家标准进行。微生物监测微生物监测药品洁净实验室沉降菌的监测照医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法的现行国家标准进行；浮游菌的监测照医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法的现行国家标准进行,浮游菌采样器可选择撞击式采样器或滤膜式采样器等表面微生物测定是对环境、设备和人员的表面微生物进行监测，方法包括接触碟法和擦拭法环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），培养温度为 3035，时间为 35 天，必要时可加入适宜的中和剂，。当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙

43、氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)，培养温度为 2025，时间为 57 天。如需要，应根据环境污染微生物种群特性选择特定的培养条件和培养时间。药品洁净实验室的监测频次及监测项目药品洁净实验室的监测频次及监测项目注：注：每月一次。每月一次。工作台面沉降菌的日常监测采样点数不少于工作台面沉降菌的日常监测采样点数不少于 3 个，且个，且每个采样点的平皿数应不小于每个采样点的平皿数应不小于 1 个。个。每季度一次。每季度一次。每半年一次每半年一次。各洁净级别环境微生物监测的动态标准警戒限和纠偏限警戒限和纠偏限 药品洁净实验室应根据历史数据，结合不同洁净区域的标准，采用适宜的方法，制定适当的微生物监测警戒限和

44、纠偏限。微生物鉴定微生物鉴定微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则（通则 9204）进行微生物控制微生物控制为了保证药品洁净实验室环境维持适当的水平，应保持空调系统的良好运行状态，对设施进行良好维护，洁净室内人员应严格遵守良好的行为规范，并定期进行环境监测。微生物控制措施还包括良好的清洁和卫生处理，应定期对药品洁净实验室进行清洁和消毒，应监测消毒剂和清洁剂的微生物污染状况，并在规定的有效期内使用，A/B 级洁净区应使用无菌的或经无菌处理的消毒剂和清洁剂。所采用的化学消毒剂应经过验证或有证据表明其消毒效果，其种类应当多于一种，并定期进行更换以防止产生耐受菌株。不得用紫外线消毒代替化学消毒。必要时，可采用气体、熏蒸等适宜的方法降低洁净区的卫生死角的微生物污染，并对熏蒸剂消毒剂的残留水平进行验证 谢 谢！