DNA重组技术的基本工具课件.ppt

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1、专题一：专题一：生物生物1的基因（的基因（目的基因目的基因）生物生物2 获得新性状获得新性状 导入导入第一至三步骤第一至三步骤三个工具三个工具第四步骤第四步骤限制酶限制酶限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶运载体运载体运载体运载体一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”1 1名称来源：名称来源：限制性核酸内切酶，又称限制酶限制性核酸内切酶，又称限制酶主要从主要从原核生物原核生物中分离纯化。中分离纯化。2 2作用特点：作用特点：识别特定核苷酸序列，使每条链中识别特定核苷酸序列，使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。1.种类与命名 现在

2、已经从约现在已经从约300种微生物中分离出了约种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶种限制性内切酶(限制酶限制酶)。粘质沙雷氏杆菌粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）S Smama大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌（EscherichiaEscherichia coli coli R R）E EcocoR R练习：练习：流感嗜血杆菌的流感嗜血杆菌的d d菌株菌株(Haemophilus(Haemophilus influenzae d)influenzae d)中先后分离到中先后分离到3 3种限制酶，则分别命种限制酶，则分别命名为名为:Hind、Hind和和Hind命命名

3、名方方法法作用特点断开磷酸二酯键断开磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键 T12345 A12345HHHHHO T12345 A12345HHHHOH2O+7仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列限制酶所识别的序列的特点是：的特点是：呈现碱基呈现碱基互补对称，无论是互补对称，无论是6个个碱基还是碱基还是4个碱基，都个碱基，都可以找到一条中心轴可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双线，中轴线两侧的双链链DNA上的碱基是上的碱基是反向反向对称重复对称重复排列的排列的，称，称为为回文序列回文序列作用特点断开磷酸

4、二酯键断开磷酸二酯键EcoR黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 作用特点断开磷酸二酯键断开磷酸二酯键Sma平末端平末端 平末端平末端AATTGCCTTAAG限制性内切酶与限制性内切酶与DNA解旋酶的区别解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键的磷酸二酯键将将DNADNA两条链的氢键两条链的氢键打开形成两条单链打开形成两条单链限制性内切酶与限制性内切酶与DNA水解酶的区别水解酶的区别切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片的磷酸二酯键，形成片段的段的DNA.DNA.切割磷酸二酯键，形成切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。单个的脱氧核苷酸。你能推测限制酶

5、存在于原核生物中的作用是你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具，防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，使之失效，从而达到

6、从而达到保护自身保护自身的的目的。目的。寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限制酶的识别切割序列的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并被切断，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA

7、的入侵。的入侵。二、“分子缝合针”DNA连接酶1 1种类种类 ：Ecoli DNA连接酶连接酶 T4 DNA连接酶连接酶2 2作用：作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键。3 3作用原理：作用原理：催化磷酸二酯键形成催化磷酸二酯键形成连接酶类型EcoliEcoliDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶来源来源来源来源功能功能功能功能大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体恢复恢复恢复恢复磷酸磷酸磷酸磷酸二酯键二酯键二酯键二酯键只能连接只能连接只

8、能连接只能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端能连接能连接能连接能连接黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和和和和平末端平末端平末端平末端(效率较低效率较低效率较低效率较低)相同点相同点相同点相同点差别差别差别差别两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺口，单链缺口，但不能连接单链但不能连接单链DNADNA！DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶

9、是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA A

10、T TT TDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用返回返回限制性内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限制，限制性内切酶性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC。在质粒上有。在质粒上有酶酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。的切点。（1）请画出质粒被限制酶）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性切割后所形成的黏性末端。末

11、端。（3）在）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？成的黏性末端能否连接？为什么？可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏可以连接。因为由两种不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）性末端是相同的（或是可以互补的）小试身手小试身手基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶

12、限制酶限制酶限制酶DNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶无切割位点一个切割位点二个切割位点EcoR 切割的目的基因切割的目的基因切割的目的基因切割的目的基因EcoREcoREcoR载体的条件载体的条件 有1多个限制酶切点目的是形成重组DNA分子用切目的基因相用切目的基因相同的限制性内切同的限制性内切酶切割质粒酶切割质粒EcoR切割质粒切割质粒一个切割位点一个切割位点目的基因目的基因一个切割位点一个切割位点载体的条件载体的条件 有1多个限制酶切点载体的条件载体的条件对受体细胞无害 能在能在受体细胞中复制和表达受体细胞中复制和表达受体细胞中复制和表达受体细胞中复制和表达载体的条件载体的条件具有标记基

13、因 1 1载体需要的条件：载体需要的条件：有1多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在导入基因能在受体细胞中复制或整合受体受体细胞中复制或整合受体受体细胞中复制或整合受体受体细胞中复制或整合受体细胞的细胞的细胞的细胞的DNADNADNADNA上上上上、表达、表达 有某些标记基因，便于筛选有某些标记基因，便于筛选三、“分子运输车”载体2 2常用运载体：常用运载体：细菌的质粒细菌的质粒噬菌体衍生物或某些动植物病毒。噬菌体衍生物或某些动植物病毒。有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目

14、的基因一起复制因一起复制裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有）之外，并具有自我自我复制能力复制能力的的很小的很小的双链环状双链环状DNA分子。分子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上在基因实际上在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作载真正被用作载体的质粒，都体的质粒，都是在天然质粒是在天然质粒的基础上进行的基础上进行过人工改造的。过人工改造的。议一议议一议2 2 2 2、能否用、能否用、能否用、能否用SARSSARSSARSSARS病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？3 3 3

15、3、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？、作为载体，若没有切割位点将怎样？4 4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞，如何鉴定？如何鉴定？如何鉴定？如何鉴定？5 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎样？将怎样？将怎样？将怎样？1 1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体

16、应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？、从化学组成来看，载体应含有什么成分？双链双链双链双链DNADNADNADNA不能不能不能不能不能进行不能进行不能进行不能进行DNADNADNADNA的重组的重组的重组的重组载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失练习练习在基因工程中，切割运载体和在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需片段，需使用（使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D.两种连接酶两种连接酶不属于质粒被

17、选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制、能复制 （）B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习3)基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基互补配对的步骤是基互补配对的步骤是 （）A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C练习练习多克隆位点英文名称：multiple cloning site;polycloning site;MCS 定义：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。人工合成的质粒pGEMT 载体基因片基因片段插入段插入位点位点