DNA复制、转录和翻译复习.ppt

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1、细胞与分子诊断系严永敏严永敏 内内 容容 提提 要要 分子诊断学分子诊断学是供高等医学检验专业本科学生使用的教是供高等医学检验专业本科学生使用的教材，也可供其他医学相关专业学生及医生参考。材，也可供其他医学相关专业学生及医生参考。本书主要内容分为以下几个方面：本书主要内容分为以下几个方面：n（1）基础篇：）基础篇：着重描述了原核生物基因组、病毒基因组、着重描述了原核生物基因组、病毒基因组、真核基因组和蛋白质组等基础理论；真核基因组和蛋白质组等基础理论；n（2）技术篇：）技术篇：介绍了生物大分子的分离纯化技术、分子克介绍了生物大分子的分离纯化技术、分子克隆技术、隆技术、DNA测序技术、测序技术、

2、PCR技术、核酸分子杂交技术、蛋技术、核酸分子杂交技术、蛋白质组研究技术和生物芯片技术等；白质组研究技术和生物芯片技术等；n（3）应用篇：）应用篇：在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、多基因疾病的分子诊断、移植配型、法医学鉴定、单核苷酸多多基因疾病的分子诊断、移植配型、法医学鉴定、单核苷酸多肽型分析以及生物信息学在分子诊断中的应用。肽型分析以及生物信息学在分子诊断中的应用。n实验实验1 1 分子生物学基本操作与训练分子生物学基本操作与训练；n实

3、验实验2 2 感受态细胞的制备，感受态细胞的制备，重组质粒导入大肠杆菌及重组子筛选重组质粒导入大肠杆菌及重组子筛选；n实验实验3 3 重组质粒重组质粒DNADNA的小量制备；的小量制备；n实验实验4 4 重组质粒重组质粒DNADNA限制性内切酶的酶切与鉴定限制性内切酶的酶切与鉴定；n实验实验5 5 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）及琼脂糖凝胶电泳；）及琼脂糖凝胶电泳；n实验实验6 6 基因组基因组DNADNA的提取与鉴定；的提取与鉴定；相关实验课程相关实验课程复习复习 DNA DNA的复制、转录和翻译的复制、转录和翻译 基因表达调控基因表达调控 DNADNA复制复制 概念概念:半保留

4、复制半保留复制,半不连续复制半不连续复制(前导链前导链,后后随链随链),),冈崎片段冈崎片段 DNA DNA复制的酶学复制的酶学 DNADNA聚合酶聚合酶(DDDP,(DDDP,多功能酶多功能酶)n起始阶段起始阶段-获得单链模板获得单链模板 解螺旋酶解螺旋酶,拓扑异构酶拓扑异构酶,单链结合蛋白等单链结合蛋白等反反转录转录 (reverse transcription)以以RNARNA为模板，合成与其互补的为模板，合成与其互补的DNADNA的过程的过程,也称也称逆转录逆转录。反反转录转录酶酶 RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性（聚合酶活性（RDDPRDDP）。）。核糖核酸酶核糖核酸酶

5、H H活性（活性（RNaseHRNaseH）。）。DNADNA聚合酶活性（聚合酶活性（DDDPDDDP）。）。反转录酶的作用合成反转录酶的作用合成cDNA：反转录酶反转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）是依赖是依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶，它以聚合酶，它以RNARNA为模板，为模板，4 4种种dNTPdNTP为底物，催化合成为底物，催化合成DNADNA，此过程称为，此过程称为反转录过程。反转录酶是反转录过程。反转录酶是多功能酶多功能酶。5 3 3 5 RNA(用用 表示表示)RNA-DNA 杂化分子杂化分子 3 5 RNase

6、 （核酸酶核酸酶H活性活性)DDDP （DNA聚合酶活性）聚合酶活性）4种种dNTP RDDP （反转录酶反转录酶）引物、引物、4种种dNTP 病毒双链病毒双链DNA用用 表示）表示）（cDNA第二链第二链(complementary DNA，cDNA)与病毒与病毒RNA 互补的互补的DNA(用用 表示表示)5 3 3 5 5 3 5 3 反转录酶的作用反转录酶的作用转录转录 (transcriptiontranscription )生物体以生物体以DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA的过程的过程转转录录RNADNA 转转 录录 的的 条条 件件：原料原料 :4 4种种NTP NTP

7、(A ATP,TP,UTPUTP,G GTP,TP,C CTP)TP)模板模板 :单链单链DNADNA 酶酶 :RNARNA聚合酶聚合酶其他蛋白质因子其他蛋白质因子复制与转录的异同复制与转录的异同?？转录起始转录起始RNARNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域;DNADNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板双链解开，使其中的一条链作为转录的模板需解决需解决两个问题两个问题：模板和模板和RNARNA聚合酶的辨认、结合聚合酶的辨认、结合5 3 3 5 结构基因结构基因调控序列调控序列RNA-pol启动子（启动子（promoterpromoter)

8、RNARNA聚合酶识别聚合酶识别,结合并起始转录的一段高度结合并起始转录的一段高度保守性保守性DNADNA序列，称为序列，称为 保守序列保守序列 （一致性序列）（一致性序列）开始转录开始转录T T G A C AA A C T G T-35 区区(Pribnow box)(Pribnow box)结合部位结合部位，影响启影响启动子复合物形成动子复合物形成；T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 区区1-30-5 010-10-40-205 3 3 5 识别部位识别部位，还决定启动子强度还决定启动子强度；原核生物启动子原核生物启动子（SextamaSextama框）框）

9、间隔区间隔区 原核生物的转录起始原核生物的转录起始2 2 DNADNA双链解开双链解开,形成形成转录空泡转录空泡1 1 RNARNA聚合酶全酶聚合酶全酶 (2 2 )与模板结合与模板结合 3 3 在在RNARNA聚合酶作用下聚合酶作用下 发生第一次聚合反应发生第一次聚合反应 5-pppGpN OH+ppiRNApol-DNA-pppGpN-OH pppGNTPpppGpN-OHppi起始复合物起始复合物:5-pppG-OH +NTP5 3 DNA原核生物转录过程中的现象原核生物转录过程中的现象核糖体核糖体RNA RNA RNA聚合酶聚合酶 转录终止转录终止-RNARNA聚合酶在聚合酶在DNAD

10、NA模板上停止前进，模板上停止前进，转录产物转录产物RNARNA链从转录复合物上脱落下来链从转录复合物上脱落下来 原核生物的转录终止子（原核生物的转录终止子（terminatorterminator）1、依赖依赖因子（因子（Rho)Rho)的转录终止的转录终止2 2、不依赖、不依赖因子因子的转录终止的转录终止 DNADNA模板上靠近终止处，有些模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列特殊的碱基序列，转，转录出录出RNARNA后，后，RNARNA产物形成产物形成特殊的结构特殊的结构来终止转录。来终止转录。TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCA

11、GCCTTTTT DNA或或UUUU CAAUCAA茎环结构茎环结构RNA5pppG5 3 3 5 茎环结构使转录终止：茎环结构使转录终止：1，使使RNARNA聚合酶变构聚合酶变构2 2，使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，RNARNA产物释放产物释放RNA-pol 真核生物的转录起始真核生物的转录起始 也需要也需要RNARNA聚合酶辨认、结合转录起点聚合酶辨认、结合转录起点 ，生成起始复合物。，生成起始复合物。-GCGC-CAAT-TATA转录起始转录起始 TATATATA盒（盒（-30-30-2525）CAAT盒盒(-75)G C盒盒(-90)基基 因因 增强子增强子(enhanc

12、er)增强转录效率增强转录效率RNARNA聚合酶聚合酶IIII启动子启动子DTATAABDNATATAFE RNARNA聚合酶与模板聚合酶与模板DNADNA的结合需一系列的结合需一系列转录因子转录因子(TF)TF)的参与。的参与。RNA聚合酶聚合酶真核生物的转录终止真核生物的转录终止 和转录后加工密切相关和转录后加工密切相关5-AAUAAA-5-AAUAAA-Poly(A)mRNA核酸酶核酸酶-GUGUGUGAATAAA GTGTGTG转录终止的修饰点转录终止的修饰点5533RNA-pol真核生物的转录后加工真核生物的转录后加工内含子（内含子（intronintron）和外显子（）和外显子（e

13、xonexon）蛋白质的生物合成蛋白质的生物合成 翻译翻译翻译（翻译（translation）是指以新生的是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸的三联体遗传密为模板，把核苷酸的三联体遗传密码翻译成氨基酸序列，合成多肽链的过程，是基因表达的最码翻译成氨基酸序列，合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。终目的。蛋白质生物合成体系蛋白质生物合成体系 模板：模板：mRNA 原料：原料：20种编码氨基酸种编码氨基酸 氨基酸运载体：氨基酸运载体：tRNA 场所：核蛋白体场所：核蛋白体 酶：氨基酰酶：氨基酰-tRNA合成酶、合成酶、转肽酶转肽酶 蛋白质因子：起始因子（蛋白质因子：起始因子（initiation

14、 factors,IF;eIF）延长因子（延长因子（elongation factors,EF）释放因子（释放因子（release factors,RF）核蛋白体释放因子（核蛋白体释放因子（ribosomal release factors,RRF）一、一、mRNA是翻译的直接模板是翻译的直接模板 开放阅读框架（开放阅读框架（open reading frame,ORF）mRNA从从5 3方向，从起始密码到终止密码的序方向，从起始密码到终止密码的序列，称为一个开放阅读框架。列，称为一个开放阅读框架。遗传密码（遗传密码（genetic codon）开放阅读框架内每开放阅读框架内每3个碱基组成的三

15、联体，决定一个氨个碱基组成的三联体，决定一个氨基酸，称为遗传密码。基酸，称为遗传密码。遗传密码的特点遗传密码的特点（一）遗传密码的连续性（一）遗传密码的连续性（commaless）（二）简并性（二）简并性（degeneracy）（三）摆动性（三）摆动性（wobble）（四）通用性（四）通用性（universal）（五）偏爱性（五）偏爱性AUGUGAUAAUAG二、核蛋白体是肽链合成的场所二、核蛋白体是肽链合成的场所 核蛋白体由大、小亚基组成，每个亚基含有不同的核蛋白体由大、小亚基组成，每个亚基含有不同的蛋白质和蛋白质和rRNA，原核生物和真核生物又各有不同。，原核生物和真核生物又各有不同。SD

16、序列（Shine-Dalgarno)原核生物特有的、位于原核生物特有的、位于mRNAmRNA上上起始密码子起始密码子上游的一段上游的一段富含富含嘌呤（嘌呤（AGGA)AGGA)碱基的短序列，是碱基的短序列，是mRNAmRNA与与核糖体小亚基核糖体小亚基结合位点结合位点，直接影响翻译效率，又称为核蛋白体结合位点，直接影响翻译效率，又称为核蛋白体结合位点（ribosomal binding siteribosomal binding site，RBSRBS）。）。基因表达调控（基因表达调控（control of gene expression）基因表达的开启或关闭以及基因活性的增加或减基因表达的开

17、启或关闭以及基因活性的增加或减弱等，受着调节和控制。弱等，受着调节和控制。基因表达基因表达(gene expressiongene expression)-通过转录及翻译产生蛋白质产物，或转录后直通过转录及翻译产生蛋白质产物，或转录后直接产生接产生RNARNA产物的过程。产物的过程。基因表达调控基因表达调控顺式作用元件顺式作用元件顺式作用元件顺式作用元件（cis-acting elementcis-acting element）特异特异DNADNA序列序列 可调节转录的可调节转录的DNADNA片段。片段。非编码序列；包括启动子、增强子、终止子、沉默子等。非编码序列；包括启动子、增强子、终止子、

18、沉默子等。反式作用因子反式作用因子反式作用因子反式作用因子（trans-acting factortrans-acting factortrans-acting factortrans-acting factor）蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转录活性的蛋白质因子录活性的蛋白质因子录活性的蛋白质因子录活性的蛋白质因子。包括转录因子，包括转录因子，包括转录因子，包括转录因子，RNARNARNARNA聚合酶等。聚合酶等。聚

19、合酶等。聚合酶等。反式作用因子反式作用因子（trans-acting factortrans-acting factor）激活蛋白激活蛋白(activator protein(activator protein）促进转录；促进转录；阻遏蛋白阻遏蛋白(repressor protein)(repressor protein)抑制转录；抑制转录；RNARNA聚合酶聚合酶 直接识别并结合启动子，解开直接识别并结合启动子，解开DNADNA双螺旋，催化合成双螺旋，催化合成转录产物；转录产物；第二节第二节 原核生物基因转录调节原核生物基因转录调节原核基因转录调节特点原核基因转录调节特点 操纵子模型的普遍性

20、操纵子模型的普遍性操纵子操纵子一个转录单位一个转录单位RNARNA聚合酶对转录起始的调节聚合酶对转录起始的调节 调节蛋白对转录起始的调节调节蛋白对转录起始的调节操纵子（操纵子（操纵子（操纵子（operonoperonoperonoperon）：）：）：）：原核生物的一段原核生物的一段原核生物的一段原核生物的一段DNADNADNADNA序列，由几个串联排列的功能相关的序列，由几个串联排列的功能相关的序列，由几个串联排列的功能相关的序列，由几个串联排列的功能相关的结结结结构基因构基因构基因构基因，加上，加上，加上，加上调控序列调控序列调控序列调控序列组成的一个完整的连续的功能单位。组成的一个完整的

21、连续的功能单位。组成的一个完整的连续的功能单位。组成的一个完整的连续的功能单位。乳糖操纵子乳糖操纵子 P P：启动子：启动子O O：操纵基因：操纵基因Z Z：-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因Y Y：通透酶基因：通透酶基因A A：乙酰基转移酶基因：乙酰基转移酶基因结结构构基基因因调调控控序序列列n n细菌对乳糖的利用及其相关的酶细菌对乳糖的利用及其相关的酶:乳糖乳糖(在通透酶作用下进入细菌内在通透酶作用下进入细菌内在通透酶作用下进入细菌内在通透酶作用下进入细菌内）半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 （细菌中少量存在）（细菌中少量存在）（细菌中少量存在）（细菌中少量存在）异乳糖异乳糖 半乳糖苷

22、酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 （细菌中少量存在）（细菌中少量存在）（细菌中少量存在）（细菌中少量存在）葡萄糖葡萄糖+半乳糖半乳糖 半半半半乳乳乳乳糖糖糖糖苷苷苷苷酶酶酶酶 （细细细细菌菌菌菌中中中中少少少少量量量量存存存存在在在在）转乙酰基酶转乙酰基酶-乙酰乙酰乙酰乙酰半乳糖半乳糖半乳糖半乳糖乳糖操纵子乳糖操纵子 细菌以细菌以葡萄糖葡萄糖为能量来源为能量来源葡萄糖充分时（葡萄糖充分时（优先利用优先利用）：）：与与葡萄糖葡萄糖代谢代谢有关的酶基因有关的酶基因-表达表达 与与其他糖代谢其他糖代谢有关的酶基因有关的酶基因-关闭关闭葡萄糖耗尽葡萄糖耗尽时，乳糖存在：时，乳糖存在：与与乳糖代谢乳糖代

23、谢有关的酶基因有关的酶基因 -表达表达 与与葡萄糖代谢葡萄糖代谢有关的酶基因有关的酶基因-关闭关闭阻遏蛋白的阻遏蛋白的负负调控调控(negativenegative control of control of repressorrepressor)n无乳糖无乳糖(no lactose):(no lactose):laclac操纵子处于操纵子处于阻遏状态阻遏状态(repression)(repression)乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时没有乳糖时)I lacZ lacY lacA 调节基因调节基因启动子启动子 操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶

24、mRNA转录转录翻译翻译阻遏蛋白与阻遏蛋白与操纵基因操纵基因结合，结结合，结构基因转构基因转录受阻录受阻阻遏蛋白阻遏蛋白有乳糖有乳糖(presence of lactose)lac操纵子被操纵子被诱诱导导(derepression,induction)诱导剂诱导剂(inducer):异乳糖、半乳糖、异乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）（异丙基硫代半乳糖苷）1、半乳糖的正调控、半乳糖的正调控乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时有乳糖时)I lacZ lacY lacA 调节基因调节基因启动子启动子 操纵基因操纵基因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶mRNA转录

25、转录翻译翻译阻遏蛋白与别乳糖结合后构象发生了改变，阻遏蛋白与别乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。基因进行转录。阻遏蛋白阻遏蛋白别乳糖别乳糖转录转录半乳糖苷酶半乳糖苷酶通透酶通透酶乙酰转移酶乙酰转移酶CAPCAP的的正正调控（调控（PositivePositive Control of CAP Control of CAP）CAP(catabolite activator protein)CAP(catabolite activator protein)分解代谢基因激活蛋白分解代谢基因激活蛋白同二聚体同二聚体 (亚基亚基22k

26、D)22kD)，是一种重要转录调节蛋白。，是一种重要转录调节蛋白。两个结合位点两个结合位点DNADNA结合域结合域 cAMP(cyclic AMP)cAMP(cyclic AMP)结合位点结合位点2、乳糖操纵子乳糖操纵子(lac operon)的调控方式的调控方式n协调调节协调调节(coordinate regulation)(coordinate regulation)负调控与正调控协调合作负调控与正调控协调合作阻遏蛋白封闭转录时，阻遏蛋白封闭转录时，CAPCAP不发挥作用不发挥作用如没有如没有CAPCAP加强转录，即使阻遏蛋白从加强转录，即使阻遏蛋白从O O上解聚上解聚仍无转录活性仍无转录活性n葡萄糖葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖葡萄糖可降低葡萄糖可降低cAMPcAMP浓度，阻碍其与浓度，阻碍其与CAPCAP结合从而抑结合从而抑制转录制转录n结论：结论：laclac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖葡萄糖