DNA重组技术的基本工具(选修3).ppt

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1、专题专题1 1 基因工程基因工程 指按照人们的愿望，进行严格的设计，并指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过通过体外体外DNADNA重组重组和和转基因转基因等技术，赋予生等技术，赋予生物以物以新的遗传特性新的遗传特性，从而创造出更符合人，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在由于基因工程是在DNADNA分子水平分子水平上进行设计上进行设计和施工的，因此又叫做和施工的，因此又叫做DNADNA重组技术重组技术。一、一、基因工程基因工程的概念的概念基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程

2、原理原理结果结果基因拼接技术基因拼接技术 或或 DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组人类需要的生物类型和生物产品人类需要的生物类型和生物产品对基因工程概念的分析对基因工程概念的分析转基因抗虫棉基因抗虫棉抗虫棉抗虫棉普通棉普通棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与运载体与运载体与运载体与运载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)

3、棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)讨论讨论2 2：外源基因（如抗虫基因）在受体内表达：外源基因（如抗虫基因）在受体内表达（产生相应的蛋白质）的理论基础是什么？（产生相应的蛋白质）的理论基础是什么？(1)(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。遗传信息的传递都遵循中心法则。(3)(3)生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。讨论讨论1：为什么不同生物的：为什么不同生物的DNA能够重组？能够重组？（1）基本组成单位相同：都是由脱氧核苷酸构成的。）基本组成单位相同：都是由脱氧核苷酸构成的。（2）空间结构相同：都

4、由两条反向平行的脱氧核苷）空间结构相同：都由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。酸长链形成的规则的双螺旋结构。（3）碱基配对方式相同：）碱基配对方式相同：A与与T配对，配对，C与与G配对。配对。71.1 DNA1.1 DNA重组技术的重组技术的基本工具基本工具DNA重重组技技术的基本工具的基本工具准确切割准确切割DNADNA的工具（的工具（“分子手分子手术刀刀”）限制性核酸内切限制性核酸内切酶 DNADNA片段的片段的连接工具（接工具（“分子分子缝合合针”）DNADNA连接接酶基因基因转移工具（移工具（“分子运分子运输车”）基因基因进入受体入受体细胞的胞的载体体一、分子手术刀一

5、、分子手术刀-限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(限制酶）限制酶）主要是从主要是从原核生物原核生物中分离纯化出来的一种酶。中分离纯化出来的一种酶。（1 1）来源：）来源：思考思考1：原核生物体内的限制酶的作用是什么？原核生物体内的限制酶的作用是什么？切割侵入的外援切割侵入的外援DNA，使之失效，从而达到保护自身，使之失效，从而达到保护自身的目的的目的。迄今已从近迄今已从近300300种不同的微生物中分种不同的微生物中分离出了约离出了约40004000种限制酶。种限制酶。（2 2）种类：）种类：思考思考2 2：限制酶是一种酶，还是一类酶？：限制酶是一种酶，还是一类酶？是一类酶是一类酶识别识别双链双

6、链DNADNA分子分子的某种的某种特定特定的核苷酸序列的核苷酸序列，并，并且使每一条链中且使每一条链中特定部位特定部位的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。（3 3）作用：）作用：（4 4）结果：）结果：形成两种末端形成两种末端黏性末端黏性末端平末端平末端两条两条反向平行反向平行的脱氧核苷酸的脱氧核苷酸长链形成的规长链形成的规则的双螺旋结则的双螺旋结构构磷酸二磷酸二酯键 G磷磷酸酸二二酯键1234512345 A13限制限制酶所所识别的序列有什么特点？的序列有什么特点？限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上

7、的碱基是反向对称重复排列的。图1-1 限制酶识别序列的中心轴线当限制酶当限制酶从识别序列的从识别序列的中心轴线处中心轴线处切开时，切开时，产生的是产生的是平末端平末端。当限制酶当限制酶从识别序列的从识别序列的中心轴线两侧中心轴线两侧切开时，切开时，产生的是产生的是黏性末端。黏性末端。在在G与与A之间切割之间切割在在C C与与G G之间切割之间切割思考：3.限制酶切割一次，形成几个末端？2个4.一段DNA被限制酶切割两次，形成几段DNA？几个末端?3段 4个5.要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？要切两个切点 产生四个黏性末端 两个(5

8、5)作用特点：作用特点：思考思考6 6：限制酶的本质是蛋白质吗？：限制酶的本质是蛋白质吗？是是专一性专一性（即（即识别特定的脱氧核苷酸序列识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点切割特定位点）高效性高效性作用条件温和作用条件温和二、连接酶二、连接酶“分子缝合针分子缝合针”1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类EcoliDNA连接酶连接酶T4DNA连接酶连接酶 是磷酸二酯键是磷酸二酯键是磷酸二酯键是磷酸二酯键（扶手）（扶手）不是氢键不是氢键不是氢键不是氢键（梯子）（梯子）3、作用：、作用：将将将将双链双链双链双链 DNADNA片段片段片段片段“缝合缝合缝合缝合”起来，恢复被限制酶切开

9、起来，恢复被限制酶切开起来，恢复被限制酶切开起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键,这样一个这样一个这样一个这样一个重组重组重组重组DNADNA分子分子分子分子就形成了就形成了就形成了就形成了。（黏性末端）（黏性末端）（黏性末端和平末端）（黏性末端和平末端）DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？连接酶有何相同点和不同点？DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶连接连接DNADNA链链连接部位连接部位相同点相同点双链双链单链单链在两在两DNADNA片段之间形片段之间形成磷酸二酯

10、键成磷酸二酯键将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3 3末端的末端的羟基上，形成磷羟基上，形成磷酸二酯键酸二酯键1 1）都能形成）都能形成磷酸二酯键磷酸二酯键2）二者都由蛋白质构成）二者都由蛋白质构成三、基因进入受体细胞的载体三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”2、常用的运载体：常用的运载体：质粒质粒 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物 动植物病毒动植物病毒u将将外源基因外源基因转移到转移到受体细胞受体细胞中去。中去。u利用载体在受体细胞内对利用载体在受体细胞内对外源基因外源基因进行大量复制。进行大量复制。1 1、载体的作用、载体的作用复制起始的复制起始

11、的复制起始的复制起始的一段序列一段序列一段序列一段序列有切割位点有切割位点有切割位点有切割位点有有有有标记基因标记基因标记基因标记基因的存在，可的存在，可的存在，可的存在，可用含氨苄青用含氨苄青用含氨苄青用含氨苄青霉素的培养霉素的培养霉素的培养霉素的培养基鉴别基鉴别基鉴别基鉴别是一种裸露的、结是一种裸露的、结构简单、独立于细构简单、独立于细菌拟核菌拟核DNA或细胞或细胞核之外核之外具有自我复具有自我复制能力制能力的很小的的很小的双双链环状链环状DNA分子分子质粒存在场所：质粒存在场所：细菌、真菌（如酵母菌）等生物的细胞质中细菌、真菌（如酵母菌）等生物的细胞质中议一议议一议2 2、能否用、能否用

12、、能否用、能否用SARSSARS病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？病毒作为基因载体？3 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？作为载体，若没有切割位点将怎样？4 4、如何鉴定携带目的基因的载体是否进入了、如何鉴定携带目的基因的载体是否进入了、如何鉴定携带目的基因的载体是否进入了、如何鉴定携带目的基因的载体是否进入了受体细胞？受体细胞？受体细胞？受体细胞？5 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，、假如目的基因导入受体细胞后不能复制，将怎

13、样？将怎样？将怎样？将怎样？1 1、从化学组成来看，载体应是单链、从化学组成来看，载体应是单链、从化学组成来看，载体应是单链、从化学组成来看，载体应是单链DNADNA还是双还是双还是双还是双链链链链DNADNA？双链双链双链双链DNADNADNADNA不能不能不能不能不能进行不能进行不能进行不能进行DNADNADNADNA的重组的重组的重组的重组载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因载体上应有标记基因可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失可能造成基因丢失载体必体必须具具备的条件的条件3、作为载体必须具备的条件、作为载体必须具备的条件u能自我复制能自我复制u有一个或多个

14、限制酶切点有一个或多个限制酶切点u具有某些标记基因具有某些标记基因u对受体细胞无害对受体细胞无害u大小应适合，便于提取和操作大小应适合，便于提取和操作思考：思考：天然的质粒天然的质粒DNADNA分子可以直接用作基因工程的载体吗？分子可以直接用作基因工程的载体吗？不能，天然的质粒不能，天然的质粒DNADNA分子并不完全具备载体的条件，都要进行人分子并不完全具备载体的条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。工改造后才能用于基因工程操作。思考与探究思考与探究1.1.限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNADNA切开吗？以下是四种不同限切开吗？以下是四种不同限制酶切割形

15、成的制酶切割形成的DNADNA片段：片段：(1)(1)CTGCACTGCA(2)(2)ACAC (3)GC (3)GC G G TGTG CG CG（4 4）G G (5)(5)G G (6)(6)GCGC CTTAACTTAA ACGTC ACGTC CGCG(7)GT(7)GT(8)AATTC(8)AATTC CA CA G G你能用你能用DNADNA连接酶将它们连接起来？连接酶将它们连接起来？2和7能连接形成ACGT TGCA；4和8能连接形成GAATTC CTTAAG；3和6能连接形成GCGC CGCG；1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。262、为什么限制酶不、为什么限制酶不能将自己的能将自己的DNA分子分子剪切掉？剪切掉？1）DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列；2）通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。2、网上网上查询：DNA连接接酶有有连接接单链DNA的本的本领吗？迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNADNA连接酶都不具有连连接酶都不具有连接单链接单链DNADNA的能力，至于原因，现在还不清的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链楚，也许将来会发现可以连接单链DNADNA的酶。的酶。28