中药制剂分析 第四章、中药制剂的含量测定.ppt

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1、第四章第四章 中药制剂的含中药制剂的含量测定量测定内蒙古医学院内蒙古医学院 药物分析教研室药物分析教研室l教学基本要求教学基本要求u掌握中药制剂含量测定中样品处理的方法掌握中药制剂含量测定中样品处理的方法u掌掌握握可可见见-紫紫外外光光谱谱法法的的基基本本原原理理；熟熟悉悉运运用用双双波波长长测测定定法法、三三波波长长测测定定法法、差差示示光光谱谱法法进进行行中中药药成成分分定定性性、定定量量的的原原理理和和方方法，了解导数光谱法的原理和操作。法，了解导数光谱法的原理和操作。u掌掌握握薄薄层层色色谱谱法法的的基基本本原原理理，定定性性、定定量量方方法法；掌掌握握高高效效液液相相色色谱谱法法的的

2、基基本本原原理理，定定性性、定定量量方方法法；掌掌握握各各类类高高效效液液相相色色谱谱法法分分离离条条件件的的选选择择；了了解解高高效效液液相相色色谱谱仪仪的组成及应用；了解液相色谱的新进展。的组成及应用；了解液相色谱的新进展。u掌掌握握气气相相色色谱谱法法的的基基本本原原理理，定定性性、定定量量方方法法；熟熟悉悉气气相相色色谱谱分分离离条条件件的的选选择择；了了解解气气相相色色谱谱仪仪的的工工作作原原理理，了了解解检检测测器器的的类型。类型。u熟熟悉悉荧荧光光分分析析法法的的基基本本原原理理及及定定性性、定定量量方方法法；了了解解库库仑仑电电量量法法、离离子子选选择择电电极极、原子吸收光谱及

3、冷原子技术。原子吸收光谱及冷原子技术。l 中中药药制制剂剂的的含含量量测测定定是是质质量量控控制制的的一一项中药指标。项中药指标。l 含含量量测测定定是是研研究究某某种种成成分分的的含含量量高高低低是否符合规定来判断药物的优劣。是否符合规定来判断药物的优劣。l 含含量量测测定定已已成成为为质质量量标标准准控控制制中中必必不不可可少的一个项目。少的一个项目。第一节第一节 含量测定样品的处理含量测定样品的处理作用作用1.将被测成分从样品中释放出来将被测成分从样品中释放出来2.除去杂质，纯化样品除去杂质，纯化样品3.富集浓缩或进行衍生化富集浓缩或进行衍生化4.使试样的形式及所用溶剂符合分析测使试样的

4、形式及所用溶剂符合分析测定的要求定的要求l一、样品的粉碎一、样品的粉碎l目的：目的：l 一一是是保保证证含含量量测测定定所所取取样样品品均均匀匀而而又又代表性提高测定结果的准确度和精密度代表性提高测定结果的准确度和精密度l 二二是是使使样样品品中中的的被被测测组组分分能能更更快快的的提提取取出来。出来。二、样品的提取二、样品的提取方法方法1.冷浸法冷浸法2.回流提取法回流提取法3.连续回流提取法连续回流提取法4.超声提取法超声提取法5.超临界流体提取法超临界流体提取法三、样品的分离净化三、样品的分离净化方法方法1.沉淀法沉淀法2.蒸馏法蒸馏法3.液液-液萃取法法液萃取法法4.色谱法色谱法5.固

5、相微萃取技术固相微萃取技术6.消化法消化法第二节第二节 测定方法的验证测定方法的验证 分分析析方方法法验验证证的的目目的的是是证证明明采采用用的的方方法法是是否否适适合合于于相相应应检检测测要要求求。在在建建立立中中药药质质量量标标准准时时，分分析析方方需需经经验验证证；在在处处方方、工工艺艺等等变变更更或或改改变变原原分分析析方方法法时时，也也需需对对分分析析方方法法进进行行验验证证。方方法法验验证证过过程程和和结结果果均均应应记记载载在在药品质量标准起草说明或修订说明中。药品质量标准起草说明或修订说明中。l 验证内容有：验证内容有：l准确度准确度l精精密密度度(包包括括重重复复性性,中中间

6、间精精密密度度,重重现现性性)l专属性、专属性、l检测限、定量限、检测限、定量限、l线性、范围线性、范围l耐用性。耐用性。l 一、准确度一、准确度l 准准确确度度系系指指用用该该方方法法测测定定的的结结果果与与真真实实值值或或参参考考值值接接近近的的程程度度，一一般般用用回回收收率率（%）表表示示。准准确确度度应应在在规规定定的的范范围围内内测测试试。用用于于定定量量测测定定的的分分析析方方法法均均需需做做准准确确度度验验证。证。l1、测定方法的准确度、测定方法的准确度l 可可用用已已知知纯纯度度的的对对照照品品做做加加样样回回收收测测定定，即即于于已已知知被被测测成成分分含含量量的的供供试试

7、品品中中再再精精密密加加入入一一定定量量的的已已知知纯纯度度的的被被测测成成分分对对照照品品，依依法法测测定定。用用实实测测值值与与供供试试品品中中含含有有量量之之差差，除以加入对照品量计算回收率。除以加入对照品量计算回收率。l 在在加加样样回回收收试试验验中中须须注注意意对对照照品品的的加加入入量量与与供供试试品品中中被被测测成成分分含含有有量量之之和和必必须须在在标标准准曲曲线线线线性性范范围围之之内内；加加入入的的对对照照品品的的量量要要适适当当，过过小小则则引引起起较较大大的的相相对对误误差差，过过大大则则干扰成分相对减少，真实性差。干扰成分相对减少，真实性差。回收率回收率%=（C-A

8、）/B100%l2、数据要求、数据要求l 在在规规定定范范围围内内，取取同同一一浓浓度度的的供供试试品品，用用6个个测测定定结结果果进进行行评评价价，或或设设计计3个个不不同同浓浓度度，每每个个浓浓度度各各分分别别制制备备3份份供供试试品品溶溶液液进进行行测测定定，用用9个个测测定定结结果果进进行行评评价价，一一般般中中间间浓浓度度加加入入量量与与所所取取供供试试品品含含量量之之比比控控制在制在1：1左右。左右。l二、精密度二、精密度l 精精密密度度系系指指在在规规定定的的测测试试条条件件下下，同同一一个个均均匀匀供供试试品品，经经多多次次取取样样测测定定所所得得结结果果之之间间的的接接近近程

9、程度度。精精密密度度一一般般用用偏偏差差、标标准偏差的相对标准偏差表示。准偏差的相对标准偏差表示。l 精精密密度度包包含含重重复复性性、中中间间精精密密度度和和重重现现性。性。l 三、专属性三、专属性l 专专属属性性系系指指在在其其他他成成分分可可能能存存在在的的条条件件下下，采采用用的的方方法法能能够够正正确确测测定定出出被被测测成成份份的特征。的特征。l 考考察察一一个个分分析析样样品品的的专专属属性性时时，应应着着重重考考察察共共存存组组分分是是否否对对被被测测组组分分的的测测定定有有干干扰。扰。l 四、线性四、线性l 线线性性系系指指在在设设计计的的范范围围内内,测测试试结结果果与与供

10、供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。l 应应在在规规定定的的范范围围内内测测定定线线性性关关系系。可可用用一一贮贮备备液液经经精精密密稀稀释释，或或分分别别精精密密称称样样，制制备备一一系系列列供供试试品品的的方方法法进进行行测测定定，至至少少制制备备5个个浓浓度度的的供供试试品品。以以测测得得的的响响应应信信号号作作为为被被测测物物浓浓度度的的函函数数作作图图，观观察察是是否否呈呈线线性性，再用最小二乘法进行线性回归。再用最小二乘法进行线性回归。l五、范围五、范围l 系系指指能能达达到到一一定定精精密密度度,准准确确度度和和线线性性,测试方法适用的高

11、低限浓度或量的区间。测试方法适用的高低限浓度或量的区间。l 范范围围应应根根据据分分析析方方法法的的具具体体应应用用和和线线性性、准准确确度度、精精密密度度结结果果及及要要求求确确定定。对对于于有有毒毒的的、具具特特殊殊功功效效或或药药理理作作用用的的成成分分，其其范围应大于被限定含量的区间。范围应大于被限定含量的区间。l 六、耐用性六、耐用性l 系系指指在在测测定定条条件件有有小小的的变变动动时时，测测定定结结果果不不受受影影响响的的承承受受程程度度，为为使使方方法法用用于于常常规规检检验验提提供供依依据据，开开始始研研究究分分析析方方法法时时，就应考虑其耐用性。就应考虑其耐用性。l 经经试

12、试验验，应应说说明明小小的的变变动动能能否否通通过过设设计的系统适用性试验，以确保方法有效。计的系统适用性试验，以确保方法有效。第三节第三节 常用定量分析方法常用定量分析方法一、化学分析法一、化学分析法u包括重量分析和滴定分析包括重量分析和滴定分析u所用仪器简单，结果准确，主要用于制所用仪器简单，结果准确，主要用于制剂中含量较高的一些成分或矿物药剂中含量较高的一些成分或矿物药 制剂中制剂中的无机分析的无机分析u灵敏度低，操作繁琐，耗时长，专属性灵敏度低，操作繁琐，耗时长，专属性不高，对微量成分测定的准确性不理想不高，对微量成分测定的准确性不理想l（一）重量分析法（一）重量分析法l 分为挥发法，

13、萃取法和沉淀法分为挥发法，萃取法和沉淀法u挥挥发发法法：测测定定具具有有挥挥发发性性或或定定量量转转化化为为挥发性物质的组分含量挥发性物质的组分含量u萃萃取取法法：根根据据被被测测组组份份在在互互不不相相溶溶的的两两相中溶解度不同，达到分离的目的相中溶解度不同，达到分离的目的u沉沉淀淀法法：将将被被测测组组份份定定量量专专为为难难溶溶性性化化合合物物，测测定定其其含含量量的的方方法法，适适用用于于制制剂剂中纯度较高的成分。中纯度较高的成分。l（二）滴定分析法（二）滴定分析法u分分为为酸酸碱碱滴滴定定，沉沉淀淀滴滴定定，配配位位滴滴定定，氧化还原滴定等氧化还原滴定等u酸酸碱碱滴滴定定法法适适用用

14、于于中中药药制制剂剂中中所所含含的的生生物碱，有机酸组分的含量物碱，有机酸组分的含量u沉沉淀淀法法分分为为银银量量法法，四四苯苯硼硼钠钠法法和和亚亚铁铁氰氰化化钾钾法法等等，中中药药用用于于测测定定生生物物碱碱，生生物物碱碱的的氢氢卤卤酸酸盐盐以以及及含含卤卤素素的的其其他他有有机机成分的含量。成分的含量。u常常用用的的配配位位滴滴定定法法包包括括EDTA法法和和硫硫氢氢酸酸铵铵法法，用用于于测测定定鞣鞣质质、生生物物碱碱及及含含有有Ca2+、Mg2+、Fe3+，Hg2+等矿物类制剂的含量等矿物类制剂的含量u氧氧化化还还原原滴滴定定法法适适用用于于测测定定具具有有氧氧化化还还原性的物质。原性的

15、物质。是是中中药药及及其其制制剂剂含含量量测测定定的的常常用用方方法法，具有灵敏度高，精度好，造作简单等优点。具有灵敏度高，精度好，造作简单等优点。要要求求被被测测组组分分本本身身或或其其显显色色产产物物对对可可见见-紫外光具有选择性吸收。紫外光具有选择性吸收。按按测测定定波波长长不不同同可可分分为为单单波波长长光光度度法法和和计计算分光光度法。算分光光度法。二、可见二、可见-紫外分光光度法紫外分光光度法l（一）单波长光度法（一）单波长光度法l 测测定定前前，必必须须经经过过适适当当的的提提取取，净净化化，或或采采用用专专属属的的显显色色反反应应等等步步骤骤来来排排除除干扰。干扰。l 选选择择

16、 max进进行行定定量量分分析析，而而共共存存组组分在此波长处基本无吸收分在此波长处基本无吸收l 吸收度读数控制在吸收度读数控制在0.3-0.7之间之间l1.吸收系数法吸收系数法 l 按按各各品品种种项项下下的的方方法法配配制制供供试试品品溶溶液液，在在规规定定的的波波长长处处测测定定其其吸吸光光度度，再再以以该该品品种种在在规规定定条条件件下下的的吸吸收收系系数数计计算算含含量量。用用本本法法测测定定时时，吸吸收收系系数数通通常常应应大大于于100，并并注意仪器的校正和检定。注意仪器的校正和检定。l2 对照品比较法对照品比较法 l 按按各各品品种种项项下下的的方方法法，分分别别配配制制供供试

17、试品品溶溶液液和和对对照照品品溶溶液液，对对照照品品溶溶液液中中所所含含被被测测成成分分的的量量应应为为供供试试品品溶溶液液中中被被测测成成分分规规定定量量的的10010,所所用用溶溶剂剂也也应应完完全全一一致。致。l3.标准曲线法标准曲线法l 先先配配制制一一系系列列浓浓度度不不同同浓浓度度的的对对照照品品溶溶液液,在在相相同同条条件件下下测测定定吸吸收收度度,绘绘制制A/C曲曲线线或或求求出出其其回回归归直直线线方方程程（r0.999）,即即得得标标准准曲曲线线。在在相相同同条条件件下下测测定定供供试试品品的的吸吸光度光度,求得供试品中被测组分的浓度或含量求得供试品中被测组分的浓度或含量.

18、l 在比色法中最常用在比色法中最常用.l（二）计算分光光度法（二）计算分光光度法l 供供试试液液中中若若有有两两种种（两两种种或或两两种种以以上上）组组分分共共存存，其其紫紫外外光光谱谱彼彼此此发发生生不不同同程程度度的的重重叠叠时时，则则可可通通过过测测定定多多个个波波长长处处的的吸吸收收度度，根根据据吸吸收收度度的的加加和和性性，采采用用适适当当的的数数学学处处理理方方式式进进行行多多组组分分的的同同时时测测定定，或或者者用用其其排排除除共共存存组组分分的的干干扰扰，测测定定其其中中某某个组分。个组分。l 三三.薄层色谱扫描法薄层色谱扫描法l 系系指指用用一一定定波波长长的的光光照照射射在

19、在薄薄层层板板上上，对对薄薄层层色色谱谱中中可可吸吸收收紫紫外外光光或或可可见见光光的的斑斑点点，或或经经激激发发后后能能发发射射出出荧荧光光的的斑斑点点进进行行扫扫描描，将将扫扫描描得得到到的的图图谱谱及及积积分分数数据据用用于于药品的鉴别、检查或含量测定。药品的鉴别、检查或含量测定。u同同HPLC相相比比：具具有有实实验验成成本本低低，流流动动相相的选择与更换方便等优点的选择与更换方便等优点u是药物制剂中常用的分析方法之一是药物制剂中常用的分析方法之一u2005版版中中国国药药典典中中有有35中中中中成成药药的的含含量测定才有薄层扫描法量测定才有薄层扫描法l（一）基本原理（一）基本原理l一

20、般是指波层色谱斑点的色谱扫描一般是指波层色谱斑点的色谱扫描l固定波长，斑点移动，测定固定波长，斑点移动，测定A-l或或F-l曲线曲线l根根据据波波层层扫扫描描的的测测定定方方式式可可分分为为薄薄层层吸吸收收扫描法和薄层荧光扫描法扫描法和薄层荧光扫描法l1.薄层吸收扫描法薄层吸收扫描法l 适适用用于于在在可可见见、紫紫外外区区有有吸吸收收的的物物质质，及及通通过过色色谱谱前前或或色色谱谱后后衍衍生生成成上上述述化化合合物物的的样样品品组组分分，可可分分别别以以氘氘灯灯和和钨钨灯灯为为光光源源，在在200-800nm波波长长范范围围内内选选择择合合适适波波长长进进行行测定。测定。l 斑斑点点中中物

21、物质质的的浓浓度度与与吸吸光光度度的的关关系系需需要用要用Kubelka-Munk理论及曲线来描述理论及曲线来描述l Kubelka-Munk理理论论以以斑斑点点的的相相对对反反射射率率和和相相对对透透光光率率表表示示薄薄层层色色谱谱斑斑点点的的吸吸光光度度，说说明明了了固固定定相相的的散散射射参参数数SX对对斑斑点点中中物物质质的的浓浓度度与与吸吸收收度度间间关关系系的的影影响响，从从而而获获得得不不同同散散射射参参数数SX时时斑斑点点的的A-KX理理论论曲曲线，即线，即Kubelka-Munk曲线。曲线。l Kubelka-Munk曲曲线线时时薄薄层层扫扫描描法法进进行行定量分析的理论依据

22、定量分析的理论依据l2.薄层荧光扫描法薄层荧光扫描法l 适适用用于于本本身身具具有有荧荧光光或或经经过过适适当当处处理理后后可可产产生生荧荧光光的的物物质质的的测测定定，光光源源用用讪讪灯灯或汞灯，采用直线式扫描。或汞灯，采用直线式扫描。l 专专属属性性强强，灵灵敏敏度度比比吸吸收收法法高高1-3个个数数量量级级，最最低低可可测测到到10-50pg样样品品，但但使使用用范范围窄围窄l 当当溶溶液液浓浓度度很很稀稀时时(ECl0.05)，荧荧光光强度与激发光强强度与激发光强I0及物质的浓度及物质的浓度C的关系为的关系为lF=2.3KI0ECll或或F=KClK为为常常数数（与与荧荧光光效效率率有

23、有关关），L为为薄薄层层板板厚度，厚度，E为吸光系数为吸光系数l Kubelka-Munk理理论论不不适适用用于于薄薄层层荧荧光光扫描，无需进行曲线校直扫描，无需进行曲线校直l 用用薄薄层层荧荧光光扫扫描描进进行行定定量量分分析析时时，用用斑斑点点荧荧光光强强的的的的积积分分值值与与斑斑点点中中组组分分的的含含量代替上式中的量代替上式中的F与与C进行运算。进行运算。l（二）定量分析方法（二）定量分析方法l1.方法学考察方法学考察l（1）工作曲线）工作曲线l目的是：目的是：u检验所选择的散射参数检验所选择的散射参数SXSX是否合适是否合适u考考察察工工作作曲曲线线是是否否通通过过原原点点，以以便

24、便确确定采用一点法或两点法定量定采用一点法或两点法定量u确定点样量的线性范围确定点样量的线性范围l（2）分离度：）分离度：l 用用于于限限量量检检查查和和含含量量测测定定时时，要要求求定定量量峰峰与与相相邻邻峰峰之之间间有有较较好好的的分分离离度度，分分离离（R）的计算公式为：）的计算公式为：lR=2（d2-d1）/(W1+W2)l 式式中中：d2为为相相邻邻两两峰峰中中后后一一峰峰与与原原点点的的距距离离；d1为为相相邻邻两两峰峰中中前前一一峰峰与与原原点点的的距距离离；W1及及W2为相邻两峰各自的峰宽。为相邻两峰各自的峰宽。l 除另有规定外，分离度应大于除另有规定外，分离度应大于1.0。l

25、（3）重复性）重复性 l 同同一一供供试试品品溶溶液液在在同同一一薄薄层层板板上上平平行行点点样样的的待待测测成成分分的的峰峰面面积积测测量量值值的的相相对对标标准准偏偏差差应应不不大大于于3.0%；需需显显色色后后测测定定的的相相对标准偏差应不大于对标准偏差应不大于5.0%。l（4）准确度考察）准确度考察l 常常用用加加样样回回收收率率来来衡衡量量，其其值值应应在在95%-105%之间，测定数据一般为之间，测定数据一般为5-6个个l（5）统计检验）统计检验l 包括包括F检验和检验和t检验检验l2.定量方法定量方法（1）外标法）外标法（2）内标法）内标法（3）回归曲线定量法）回归曲线定量法外标

26、一点法外标一点法外标两点法外标两点法l四、气相色谱法四、气相色谱法l（一）基本原理（一）基本原理l 气气化化后后的的试试样样被被载载气气带带入入色色谱谱柱柱，由由于于各各组组分分在在两两相相间间的的作作用用不不同同，在在色色谱谱柱柱中中移移动动有有快快有有慢慢，经经一一定定柱柱长长后后得得到到分分离离，以以此此被被载载气气带带入入检检测测器器，将将各各组组分分浓浓度度或或质质量量变变化化转转化化为为电电信信号号变变化化记记录录为为色色谱谱图图，利利用用色色谱谱峰峰保保留留值值进进行行定定性性分分析析，利利用用峰峰面积或峰高进行定量分析。面积或峰高进行定量分析。l(1)色谱柱的理论板数色谱柱的理

27、论板数(n)n（）tR=5.54tRW1/2=16（）tR W（）l2.速率理论速率理论H=A+B/u+Cul3.分离度分离度 2(tR2tR1)R W1W2 l4.系统适应性系统适应性l（1）色谱柱的理论塔板数）色谱柱的理论塔板数l（2）分离度）分离度 R1.5l（3）重复性）重复性 2.0%l（4）拖尾因子）拖尾因子 0.95-1.05l（二）实验条件的选择（二）实验条件的选择u1.固定相的选择固定相的选择u2.柱温的选择柱温的选择u3.载气的选择载气的选择u4.其他条件的选择其他条件的选择u5.检测器检测器l（三）定量分析方法（三）定量分析方法（1）内标法加校正因子）内标法加校正因子（2

28、）外标法）外标法（3）归一法）归一法（4）标准溶液加入法）标准溶液加入法l五、高效液相色谱法五、高效液相色谱法l（一）基本原理（一）基本原理l(1)色谱柱的理论板数色谱柱的理论板数(n)n（）tR=5.54tRW1/2=16（）tR W（）l2.速率理论速率理论H=A+Cul（二）（二）实验条件的实验条件的选择选择l.色谱柱选择色谱柱选择l.流动相选择流动相选择l.洗脱方式洗脱方式l.检测器检测器l.前处理前处理l（三）法分类及方法（三）法分类及方法.键合相色谱法键合相色谱法.胶束色谱法胶束色谱法.反相键合相色谱反相键合相色谱.正相键合相色谱正相键合相色谱.离子对色谱法离子对色谱法.离子抑制色谱法离子抑制色谱法l六、荧光分析法六、荧光分析法l七、原子吸收分光光度法七、原子吸收分光光度法