Westernblot实验介绍及流程.ppt

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1、Western blot Western blot 实验介绍实验介绍及流程及流程Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置垂直电泳、电转装置目的与要求目的与要求 掌握垂直电泳、电转的基本原理与操作步骤培训内容培训内容 熟悉western-blot 与SDS-PAGE的基本原理与实验流程考核题目考核题目电泳槽 玻璃板、梳子、加样校准架等电转移槽 切胶板、黑白夹板、海绵垫等电泳仪 Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置垂直电泳、电转装置Western blot是是利利用用已已知知的的特特异异性性抗抗体体与与抗抗原原（即即组组织织细细胞胞中中的的目目的的蛋蛋白白）能能特特异异性性结结合合

2、的的原原理理，通通过过化化学学反反应应使使标标记记于于结结合合后后的的特特异异性性抗抗体体上上的的显显示示剂剂（如如酶酶、金金属属离离子子、同同位位素素）显显示示一一定定的的颜颜色色或或发发光光来来对对组组织织细细胞胞内目的蛋白定性及半定量的研究。内目的蛋白定性及半定量的研究。Westernblot实验原理抗原抗原一抗一抗生物素标记生物素标记的二抗的二抗ECL发光试剂发光试剂Western blot 检测蛋白表达实验流程提取总蛋白蛋白浓度测定SDSSDS-聚丙烯聚丙烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳ECL检测检测封闭二抗二抗一抗一抗洗涤洗涤扫描分析转膜转膜 SDS电泳技术首先在1967年由Shapir

3、o建立,1969年由Weber和Osborn进一步完善。SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，是在PAGE凝胶中引进SDS（十二烷基磺酸钠，含有大量带负电荷的SO32-），SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强还原剂的溶液中可与蛋白质形成SDS-SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物（电泳样品加入样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟）。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的蛋白质穿上带负电的“外衣外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大小。迁移率主要取决于其分子量的大

4、小。SDS-PAGESDS-PAGE电泳的基本原理电泳的基本原理1AproteinsampleissubjectedtoelectrophoresisonanSDS-polyacrylamidegel.Westernblot实验流程SDS-PAGE电泳操作步骤电泳操作步骤（1）配制分离胶）配制分离胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶（2）灌分离胶）灌分离胶 灌胶之上轻轻加一层水或正丁醇液（3）配制浓缩胶）配制浓缩胶 注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶（4）灌浓缩胶）灌浓缩胶 倒掉分离胶上的水或正丁醇之后，倒置吸净残留溶液，灌注浓缩胶，将梳子插好,胶凝固好后有胶条的国产槽

5、需要去掉胶条（浓缩胶与分离胶一般比例为1：3）（5）加）加Tris-甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 足量（6）上样）上样 蛋白质含量要适量，上样总体积要适量（7）电泳）电泳 50V1h,100V2.5h，根据分子量的大小确定电压和时间，一般溴酚蓝离胶下cm停止电泳，上槽上槽接负极，下槽接正极接负极，下槽接正极 2Electroblottingtransferstheseparatedproteinsfromthegeltothesurfaceofanitrocellulosemembrane.Westernblot实验流程（1）剥胶）剥胶 用切胶板切去浓缩胶和多余的分离胶（2）准备滤纸和硝酸

6、纤维素膜）准备滤纸和硝酸纤维素膜 切滤纸和膜时一定要戴手套，大小与胶一致（3）浸泡滤纸、膜和海绵垫）浸泡滤纸、膜和海绵垫 用转移液（含甲醇）浸泡，开门通风（4）制备）制备“三明治三明治”制备每一层时注意赶气泡（5）电转）电转 75V，1.5h，在冰浴中进行，黑板对黑极（），白板对白极（）黑板对黑极（），白板对白极（）电转操作步骤电转操作步骤4Anantibodythatisspecificfortheproteinofinterest(theprimaryantibody-Ab1)isaddedtothenitrocellulosesheetandreactswiththeantigen.On

7、lythebandcontainingtheproteinofinterestbindstheantibody,formingalayerofantibodymoleculesWesternblot实验流程一抗孵育一抗孵育一抗孵育一抗孵育：必须选择可以抗抗原：必须选择可以抗抗原种属的一抗。如做大鼠目的蛋白种属的一抗。如做大鼠目的蛋白的检测，则我们选择的一抗可以的检测，则我们选择的一抗可以是来自兔、人、小鼠的是来自兔、人、小鼠的抗大鼠抗大鼠的的抗体。一抗浓度及孵育时间、温抗体。一抗浓度及孵育时间、温度很重要。度很重要。3Theblotisincubatedwithagenericprotein(

8、suchasmilkproteinsorBSA)whichbindstoanyremainingstickyplacesonthenitrocellulose.5Followingseveralrinsesforremovalofnon-specificallyboundAb1,theAb1-antigencomplexonthenitrocellulosesheetisincubatedwithasecondantibody(Ab2),whichspecificallyrecognizestheFcdomainoftheprimaryantibodyandbindsit.Ab2isradio

9、activelylabeled,oriscovalentlylinkedtoareporterenzyme,whichallowstovisualizetheprotein-Ab1-Ab2complex.Westernblot实验流程二抗孵育二抗孵育二抗孵育二抗孵育：二抗的选择根：二抗的选择根据一抗的种属来源，如：据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗体，则二抗应选择山的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体，羊或其他来源抗兔的抗体，而且二抗要标记有同位素而且二抗要标记有同位素或酶。或酶。Westernblot实验流程6ECLdetectionECLKiti

10、sbasedontheenzyme-linkedimmunodetectionofantigen-specificantibodyusinganti-IgGsecondaryantibodiesconjugatedtohorseradishperoxidase(HRP),whichreactswithachemiluminescentsubstrateinthepresenceofachemicalenhancer.ECLECL显色显色显色显色：ECLECL试试剂与过氧化物酶剂与过氧化物酶结合后发光后，结合后发光后，可用仪器自动检可用仪器自动检测或在暗室内用测或在暗室内用X-X-光片将其记录光

11、片将其记录下来。下来。Westernblot实验结果与分析 c-fosactin62kD42kD将X-光片在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描，比较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值，可得到蛋白表达半定量分析结果考核题目考核题目1.Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置的主要用途是什么？垂直电泳、电转装置的主要用途是什么？2.Bio-radBio-rad垂直电泳、电转装置主要由哪几部分构成？垂直电泳、电转装置主要由哪几部分构成？3.SDS-PAGE SDS-PAGE电泳中蛋白质迁移速率的快慢取决于什么？电泳中蛋白质迁移速率的快慢取决于什么？4.SDS-PAGE SDS-PAGE电泳的操作步骤是什么？注意事项有哪些？电泳的操作步骤是什么？注意事项有哪些？5.SDS-PAGE SDS-PAGE电转移的操作步骤是什么（详细列出电转移的操作步骤是什么（详细列出“三明治三明治”的先后顺序的先后顺序)？注意事项有哪些？注意事项有哪些？6.Western-Blot Western-Blot的基本原理是什么？的基本原理是什么？