lisiman实验二血清蛋白的盐析及清球比值测定.ppt

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1、医学生物化学与分子生物学实验教程 第三篇第三篇 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验第二十一章第二十一章 综合性实验综合性实验实验实验3 3 血清蛋白的盐析及清血清蛋白的盐析及清/球比值测定球比值测定 P P179179 实实 验验 二二 血清蛋白的盐析及清血清蛋白的盐析及清/球比值测定球比值测定掌握盐析的原理和方法。掌握盐析的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。了解血清蛋白质定量测定的临床意义。了解血清蛋白质定量测定的临床意义。【实验目的实验目的】（Experimental Objectives）(Experimental

2、Principles)o蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质o蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应考马斯亮兰染色法考马斯亮兰染色法 【实验原理实验原理】盐析盐析：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。（1 1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素电荷电荷(同种电荷相斥）同种电荷相斥）水化膜（隔离）水化膜（隔离）Pr+Pr+中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。【实验原理实验原理】中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白

3、质分子周围的水化膜层减弱力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。沉淀蛋白质的方法还有哪些？【实验原理实验原理】o蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。o沉沉淀淀的的原原因因:破破坏坏水水化化膜膜;改改变变蛋蛋白白质质表表面面基团的解离。基团的解离。o沉沉淀淀的的方方法法:盐盐析析法法

4、;有有机机溶溶剂剂法法;重重金金属属盐盐沉淀法沉淀法;生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。【实验原理实验原理】o正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分约约60%60%以上，其余为球蛋白，两者比例为：以上，其余为球蛋白，两者比例为：1 1。兔血清清球比：。兔血清清球比：1 1。o清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。将清蛋白和球蛋白分离。【实验原

5、理实验原理】蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应考马斯亮蓝显色法考马斯亮蓝显色法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250（Coomassie brilliant blueCoomassie brilliant blue）与蛋白质中的碱）与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色蓝色。此时蛋白质。此时蛋白质-色素结色素结合物在合物在595nm595nm波长波长下有最大光吸收。常用于快速定量分析。下有最大光吸收。常用于快速定量分析。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250【仪器试剂仪器试剂】o血清、饱和硫酸铵溶液、标准蛋白溶液、血清、饱和硫酸铵溶液、标准蛋白

6、溶液、考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250 o722S型分光光度计；型分光光度计；标准曲线的绘制及标准曲线法标准曲线的绘制及标准曲线法 1 2 3 4 5 样品标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AXACXAX1.1.标准曲线制作标准曲线制作（1 1）蛋白标准液的倍比稀释：）蛋白标准液的倍比稀释：管管管管 号号号号1 1 1 12 2 2 23 3 3 34 4 4 40.9%NaCl 0.9%NaCl 0.9%NaCl 0.9%NaCl 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 标

7、准蛋白溶液标准蛋白溶液标准蛋白溶液标准蛋白溶液（1mg/ml1mg/ml1mg/ml1mg/ml）由由由由2 2 2 2中取中取中取中取200l200l200l200l由由由由3 3 3 3中取中取中取中取200l200l200l200l由由由由4 4 4 4中取中取中取中取200l200l200l200l400l400l400l400l1 1 1 10.50.50.250.250.1250.125蛋白质终浓度蛋白质终浓度（mg/mlmg/mlmg/mlmg/ml）【操操 作作 步步 骤骤】（Operating Procedure）（2 2）标准曲线的制作）标准曲线的制作管管 号号0 01 1

8、2 23 34 4考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250 G-250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 0.9%NaCl 0.9%NaCl 100l 100l 对应加入倍比对应加入倍比稀释的稀释的蛋白标准液蛋白标准液 100l 100l 100l 100l 100l 100l 100l 100l 蛋白质含量蛋白质含量（gg）0 012.512.525255050100100A A595nm595nm n n 将溶液充分混合，将溶液充分混合，将溶液充分混合，将溶液充分混合，放置放置放置放置2min2min2min2min后后后后开始测吸光度开始测吸光度开始测

9、吸光度开始测吸光度A A A A595nm595nm595nm595nm.【操操 作作 步步 骤骤】（Operating Procedure）（一）（一）血清蛋白的盐析血清蛋白的盐析 取取1.5 ml EP1.5 ml EP管管1 1支支+0.5 ml+0.5 ml血清血清滴加饱和硫酸铵滴加饱和硫酸铵0.5 ml0.5 ml（血清已被稀释了（血清已被稀释了2 2倍）倍），边加边混匀，边加边混匀室温静置室温静置5 5分钟后，分钟后，10000rpm10000rpm，离心，离心2 2分钟分钟转移上清至另一支转移上清至另一支EPEP管内备用，此为管内备用，此为盐析上清盐析上清。(二二).).血清中蛋

10、白质浓度的测定血清中蛋白质浓度的测定（1 1）血清样品的稀释：取）血清样品的稀释：取2 2支支1.5 ml EP1.5 ml EP管，管，标记标记1 1号、号、2 2号，按下表稀释号，按下表稀释.留留2 2号管备用。号管备用。管管管管 号号号号1 1 1 1号号号号2 2 2 2号号号号0.9%NaCl0.9%NaCl0.9%NaCl0.9%NaCl180l180l180l180l380l380l380l380l血血血血 清清清清20l20l20l20l由由由由1 1 1 1号中取号中取号中取号中取 20l20l20l20l总蛋白（2 2）盐析上清（清蛋白）的稀释：取）盐析上清（清蛋白）的稀释

11、：取2 2支支1.5 ml EP1.5 ml EP管管 标记标记3 3号、号、4 4号，按下表稀释号，按下表稀释管管管管 号号号号3 3 3 3号号号号4 4 4 4号号号号0.9%NaCl0.9%NaCl0.9%NaCl0.9%NaCl180l180l180l180l180l180l180l180l盐析上清盐析上清（清蛋白）（清蛋白）20l20l20l20l由由由由3 3 3 3号中取号中取号中取号中取20l20l20l20l清蛋白（3 3）血清中蛋白质浓度的测定：取）血清中蛋白质浓度的测定：取2 2支大试管，支大试管，标记标记5 5号、号、6 6号，按下表加入试剂。号，按下表加入试剂。管管

12、管管 号号号号5 5 5 5号号号号6 6 6 6号号号号考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250G-250G-250）3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 稀释血清稀释血清稀释血清稀释血清（2 2 2 2号管）号管）号管）号管）100l 100l 100l 100l 稀释盐析上清稀释盐析上清稀释盐析上清稀释盐析上清（4 4 4 4号管）号管）号管）号管）100l 100l 100l 100l A595nmA595nmA595nmA595nm？蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质浓度蛋白质浓度（mg/mlmg/mlmg/mlmg/ml）？取样后充分混合，取样

13、后充分混合，放置放置2min2min后后,记录记录A A595nm595nm，并通过，并通过标准曲线查得待测样品中蛋白质浓度。标准曲线查得待测样品中蛋白质浓度。清蛋白总蛋白（三）绘制标准曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白（三）绘制标准曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白 浓度及清浓度及清/球比值。球比值。o血清蛋白（总蛋白）浓度血清蛋白（总蛋白）浓度 =图示值图示值200200（稀释倍数）（稀释倍数）=（mg/mlmg/ml）o盐析上清（清蛋白）浓度盐析上清（清蛋白）浓度 =图示值图示值200200（稀释倍数）（稀释倍数）=（mg/mlmg/ml）o计算清计算清/球比值球比值:清蛋白的浓度清蛋白的浓度/

14、（总蛋白的浓度（总蛋白的浓度-清蛋白的浓度）清蛋白的浓度）=思考题思考题(Questions)(Questions)o蛋白质分离纯化的方法？蛋白质分离纯化的方法？o凯氏定氮法凯氏定氮法o双缩脲法双缩脲法(Biuret)o紫外吸收法紫外吸收法o考马斯亮蓝法（考马斯亮蓝法（Bradford）oFolin酚试剂法 血清蛋白质测定的临床意义血清蛋白质测定的临床意义 肝脏的基本功能肝脏的基本功能肝脏是人体内的最大腺体肝脏是人体内的最大腺体o代谢功能代谢功能9090蛋白、糖、脂、胆汁酸、胆红素、激素灭活及部分金属蛋白、糖、脂、胆汁酸、胆红素、激素灭活及部分金属o生物转化功能生物转化功能氧化、还原、水解、结

15、合氧化、还原、水解、结合o分泌和排泄功能分泌和排泄功能 1、血液生化检验（肝功检查）血液生化检验（肝功检查）肝脏的合成功能：总蛋白（肝脏的合成功能：总蛋白（TPTP）、清蛋白（）、清蛋白（ALBALB）、球蛋白（）、球蛋白（GLOGLO）肝细胞受损的情况：谷丙转氨酶（肝细胞受损的情况：谷丙转氨酶（ALTALT）、谷草转氨酶（）、谷草转氨酶（ASTAST）肝细胞的代谢功能：直接胆红素（肝细胞的代谢功能：直接胆红素（DBILDBIL）、总胆红素（）、总胆红素（TBILTBIL）2、病毒标记检测（乙肝五项）。病毒标记检测（乙肝五项）。肝脏病的实验室检查主要包括两个肝脏病的实验室检查主要包括两个方面方

16、面：血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定一、一、一、一、蛋白质代谢蛋白质代谢蛋白质代谢蛋白质代谢功能检查功能检查功能检查功能检查正常成人血清：正常成人血清：总蛋白总蛋白 60-80g60-80gL L 清蛋白清蛋白 40-55g40-55gL L 球蛋白球蛋白 20-30g20-30gL L A AG 1.5-2.5:1G 1.5-2.5:1 参考值范围参考值范围参考值范围参考值范围 蛋白质代谢功能检查蛋白质代谢功能检查 血清总蛋白血清总蛋白 （Serum total protein；TP）静脉

17、采血静脉采血2ml2ml，不抗凝，分离血清进行测定。，不抗凝，分离血清进行测定。血清总蛋白包括白蛋白及球蛋白。血清总蛋白包括白蛋白及球蛋白。【正常参考值正常参考值】60 6080 g/L80 g/L【异常结果分析异常结果分析】总蛋白总蛋白增高增高：急性失水所致血液浓缩，如严重呕吐，腹泻，大量出汗急性失水所致血液浓缩，如严重呕吐，腹泻，大量出汗。某些球蛋白增多疾病，如多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症等某些球蛋白增多疾病，如多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症等总蛋白总蛋白降低降低：病因基本同清蛋白降低病因基本同清蛋白降低 清蛋白（清蛋白（AlbuminAlbumin；ALBALB）静脉采血静脉采血2ml,2ml

18、,不抗凝，分离血清进行测定。不抗凝，分离血清进行测定。清蛋白几乎都由肝脏合成，它是血浆中的主要蛋白成分，清蛋白几乎都由肝脏合成，它是血浆中的主要蛋白成分，具有结合，转运其他分子、维持血浆胶体渗透压等重要作用。具有结合，转运其他分子、维持血浆胶体渗透压等重要作用。【正常参考值正常参考值】40 40 55 g/L55 g/L 【异常结果分析异常结果分析】清蛋白降低：清蛋白降低：肝细胞病变：慢性肝炎，肝硬化，肝坏死，肝癌，肝功能严肝细胞病变：慢性肝炎，肝硬化，肝坏死，肝癌，肝功能严 重受损等。重受损等。蛋白丢失过多：肾病综合征，大面积烧伤，浆膜渗出性损害等蛋白丢失过多：肾病综合征，大面积烧伤，浆膜渗

19、出性损害等 蛋白摄入不足：如营养不良，慢性腹泻，吸收不良综合征等。蛋白摄入不足：如营养不良，慢性腹泻，吸收不良综合征等。慢性消耗性疾病：如恶性肿瘤，结核病，甲状腺功能亢进，慢性消耗性疾病：如恶性肿瘤，结核病，甲状腺功能亢进，长期慢性发热等。长期慢性发热等。清蛋白球蛋白比值清蛋白球蛋白比值（AG）静脉采血静脉采血2ml2ml，不抗凝，分离血清进行测定，不抗凝，分离血清进行测定【正常参考值正常参考值】1.51.52.52.5 【异常结果分析异常结果分析】A AG G比值比值1 1提示有慢性肝实质性损害。提示有慢性肝实质性损害。动态观察动态观察A AG G比值可提示病情的发展和估计预比值可提示病情的

20、发展和估计预 后，病情恶化时清蛋白逐渐减少，后，病情恶化时清蛋白逐渐减少，A AG G比值下比值下 降，降，A AG G比值持续倒置表示预后较差。比值持续倒置表示预后较差。可以是清蛋白降低或球蛋白增高。可以是清蛋白降低或球蛋白增高。见于严重肝功能损伤及见于严重肝功能损伤及M M蛋白血症，如慢性肝炎、肝硬化、蛋白血症，如慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。原发性肝癌、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。临床意义临床意义临床意义临床意义 AG倒倒置置下次实验：下次实验：o第三篇第三篇 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验o第二十章第二十章 基础性实验基础性实验o实验实验3 3 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制作用竞争性抑制作用 P P123123