动物体内过氧化物酶活性的.ppt

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1、动物体内过氧化物酶活性的测定廖百建1、原理过氧化物酶 过氧化物酶peroxidase,POD 广泛存在于各种动物体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应:RH2+H2O22H2O+R通过测定420nm处吸光度的变化得出酶的活性2POD 分子结构特点分子结构特点POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白,脱辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。3、POD的主要生理功能参与活性氧代谢过程；参与活性氧代谢过程；注：除了与动物正常代谢和生长发育相关的结构型POD外,很大部分POD的合成属于诱导表达型。4、实验材料与试剂实验材料：蝗虫的幼虫420nm的分光光度计恒温水浴箱试剂试剂一：60ml液体

2、*4瓶，4保存6个月。试剂二;粉剂*3瓶，4保存6个月。试剂二应用液的配制：临用每瓶粉剂加入10ml的双蒸馏水溶解，4保存避光试剂三：5ml瓶液*1瓶4保存6个月。试剂三应用液的配制：临用前用蒸馏水15倍稀释，使得1cm光径，双蒸馏水调零时A240保持在0.4左右，现用现配。若A值太高，则加双蒸馏水稀释，若A值太低，则加入适量试剂三。（一般在25倍左右稀释）试剂四：50ml液体*2瓶，4保存6个月5、实验步骤1.前处理蝗虫幼虫匀浆的制备，准确称取幼虫的重量，按照重量（g):体积（ml)=1:9的比例加入9倍体积的匀浆介质（建议使用生理盐水或磷酸盐缓冲液：0.1mol/lPH77.4)冰浴下制备

3、成10%的幼虫匀浆液，4000转/分离心10分钟后，取上清420nm处，1cm光径。100ul进行OD值的测定测定管对照管试剂一（ml)2.42.4试剂二应用液(ml)0.30.3试剂三应用液（ml)0.2双蒸馏水（ml)0.2样本0.10.137水浴准确反应30分钟试剂四（ml)1.01.02.操作表6、计算酶活性选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算；以每分钟每分钟ODOD值变化值变化0.010.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。酶活力=（测定OD值-对照OD值）*反应总体积(ml)*1000/12*比色光径（cm)*取样量(ml)*反应时间（30分钟）*匀浆蛋白浓度(mgport/ml)1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。3封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。4底物请避光保存。5试验结果判定必须以酶标仪读数为准.6所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。7本试剂不同批号组分不得混用。7.7.注意事项注意事项