课题3　血红蛋白的提取和分离 (6).ppt

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1、课题课题3血血红红蛋白的提取和分离蛋白的提取和分离课标领课标领航航1概概述述凝凝胶胶色色谱谱法法、电电泳泳法法等等分分离离大大分分子子的基本原理。的基本原理。2能能根根据据凝凝胶胶色色谱谱过过程程中中的的现现象象和和结结果果，评评价价实实验验操操作作的的过过程程是是否否规规范范，分分析析实实验验结结果。果。3尝尝试试对对血血液液中中血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离，体体验验从从复复杂杂的的体体系系中中提提取取生生物物大大分分子子的的基基本本过过程和方法。程和方法。【重点重点】凝胶色凝胶色谱谱法、法、电电泳法基本原理。泳法基本原理。【难难点点】实验实验操作的操作的过过程及分析。程及分析。

2、情境导引情境导引为为年老多病的人注射丙种年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增球蛋白，可以在一定程度上增强强其身体的抵抗力。在其身体的抵抗力。在动动物体内，物体内，丙种球蛋白和丙种球蛋白和许许多蛋白多蛋白质质混合混合在一起。要在一起。要获获得得纯净纯净的丙种球蛋的丙种球蛋白制品，就必白制品，就必须进须进行提取和分离。行提取和分离。电电泳利用了待分离泳利用了待分离样样品中各种分子品中各种分子带电带电性性质质的差的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电带电分分子子产产生不同的迁移速度，从而生不同的迁移速度，从而实现实现了了样样品中各种品中各种分子的分

3、离。分子的分离。基础自主梳理基础自主梳理一、凝胶色一、凝胶色谱谱法法1概概念念：也也称称作作分分配配色色谱谱法法，是是根根据据_质质量的大小分离蛋白量的大小分离蛋白质质的有效方法。的有效方法。2原理原理(1)由由微微小小的的多多孔孔球球体体构构成成的的凝凝胶胶，内内部部有有许许多多贯贯穿的通道。穿的通道。相相对对分子分子(2)由由相相对对分分子子质质量量不不同同的的蛋蛋白白质质通通过过凝凝胶胶时时，相相对对分分子子质质量量_的的蛋蛋白白质质容容易易进进入入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，路路程程较较长长，移移动动速速度度较较慢慢，而而相相对对分分子子质质量量较较大大的的蛋蛋白白质质无无法法进进入

4、入凝凝胶胶内内部部的的通通道道，只只能能在在_移移动动，路路程程较较短短，移移动动速速度度较较快快，从从而而使使相相对对分分子子质质量量不不同同的蛋白的蛋白质质分子得以分离。分子得以分离。二、二、缓缓冲溶液冲溶液1作用：在一定范作用：在一定范围围内，抵制外界的内，抵制外界的_对对溶溶液液pH的影响，的影响，维维持持pH基本不基本不变变。较较小小凝胶外部凝胶外部酸和碱酸和碱2配配制制：由由12种种缓缓冲冲剂剂溶溶解解于于水水中中配配制制而而成成，通通过过调调节节缓缓冲冲剂剂的的_就就可可以以得得到到不不同同pH范范围围内使用的内使用的缓缓冲液。冲液。三、三、电电泳泳1概概念念：指指_在在电电场场

5、的的作作用用下下发发生生迁迁移移的的过过程。程。2原原理理：在在一一定定的的pH下下，多多肽肽、核核酸酸等等生生物物大大分分子子的的可可解解离离基基团团会会带带上上正正电电或或负负电电，在在电电场场的的作作用用下下，这这些些带带电电分分子子会会向向着着与与其其所所带带电电荷荷_的的电电极移极移动动。使用比例使用比例带电带电粒子粒子相反相反3作用：作用：电电泳利用了待分离泳利用了待分离样样品中各种分子品中各种分子带电带电性性质质的差异及分子本身的大小、的差异及分子本身的大小、_的不同，使的不同，使带带电电分子分子产产生不同的生不同的_，从而，从而实现样实现样品中品中各种分子的分离。各种分子的分离

6、。4方法：常用的方法：常用的电电泳方法有泳方法有琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳和聚泳和聚丙丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳。泳。四、四、实验实验操作操作1样样品品处处理：通理：通过过_、_、分离血、分离血红红蛋白溶液等操作蛋白溶液等操作收集血收集血红红蛋白溶液。蛋白溶液。(1)红细红细胞的洗胞的洗涤涤：目的是去除：目的是去除杂杂蛋白。分离蛋白。分离时时采取采取低速短低速短时间时间离心，直至上清液中没有黄色，表明离心，直至上清液中没有黄色，表明红红细细胞已洗胞已洗涤涤干干净净。形状形状迁移速度迁移速度红细红细胞的洗胞的洗涤涤血血红红蛋白的蛋白的释释放放思考感悟思考感悟1洗洗涤涤红红细细胞胞时时为为什什么

7、么不不能能用用蒸蒸馏馏水水代代替替生生理理盐盐水？水？【提示提示】生理生理盐盐水能保持水能保持红细红细胞的渗透胞的渗透压稳压稳定定而不至于破裂。在未洗而不至于破裂。在未洗净净血血浆浆中的中的杂质杂质蛋白前，蛋白前，红细红细胞如果提前破裂，就可能使血胞如果提前破裂，就可能使血红红蛋白与蛋白与杂质杂质血血浆浆蛋白混在一起，加大了分离的蛋白混在一起，加大了分离的难难度。度。(2)血血红红蛋蛋白白的的释释放放：在在蒸蒸馏馏水水和和_的的作作用下，用下，红细红细胞破裂，胞破裂，释释放出血放出血红红蛋白。蛋白。甲苯甲苯思考感悟思考感悟2在在血血红红蛋蛋白白释释放放过过程程中中，加加入入蒸蒸馏馏水水和和甲甲

8、苯苯的的目的是什么？目的是什么？【提示提示】(1)加入蒸加入蒸馏馏水使水使红细红细胞吸水胞吸水涨涨破。破。(2)细细胞膜的主要成分胞膜的主要成分为为磷脂，易溶于甲苯等有机磷脂，易溶于甲苯等有机溶溶剂剂，加入甲苯能加速，加入甲苯能加速红细红细胞破裂并胞破裂并释释放出血放出血红红蛋白。蛋白。(3)分分离离血血红红蛋蛋白白溶溶液液：把把搅搅拌拌好好的的混混合合液液离离心心后后,将将试试管管中中的的液液体体用用滤滤纸纸过过滤滤，除除去去脂脂溶溶性性沉沉淀淀层层,于于分分液液漏漏斗斗中中静静置置片片刻刻后后，分分离离出出下下层层的的红红色色透透明明液体。液体。2粗分离：即透析粗分离：即透析(1)方方法法

9、：将将血血红红蛋蛋白白溶溶液液装装入入透透析析袋袋，将将透透析析袋袋放入一定量适宜放入一定量适宜浓浓度的度的_中，透析中，透析12h.(2)目的：将目的：将样样品中分子品中分子较较小的小的杂质杂质除去。除去。(3)原理：透析袋能使小分子自由原理：透析袋能使小分子自由进进出，而将大分出，而将大分子物子物质质保留在袋内。保留在袋内。磷酸磷酸缓缓冲液冲液3纯纯化化：通通过过凝凝胶胶色色谱谱柱柱将将相相对对分分子子质质量量较较大大的的杂杂质质蛋白除去。操作如下：蛋白除去。操作如下：(1)凝胶色凝胶色谱谱柱的制作。柱的制作。(2)凝胶色凝胶色谱谱柱的装填柱的装填材料：本材料：本实验实验使用的是交使用的是

10、交联联葡聚糖凝胶。葡聚糖凝胶。方方法法：凝凝胶胶用用_充充分分溶溶胀胀后后，配配成成凝凝胶胶悬悬浮浮液液，一一次次性性缓缓慢慢倒倒入入色色谱谱柱柱内内。不不能能有有_存存在在；不能不能发发生洗脱液流干露出凝胶生洗脱液流干露出凝胶颗颗粒的粒的现现象。象。(3)样样品的加入和洗脱品的加入和洗脱a.准准备备：加加样样前前，打打开开流流出出口口，使使柱柱内内凝凝胶胶面面上上的的缓缓冲液冲液缓缓慢下降到与慢下降到与_平平齐齐，关，关闭闭出口。出口。蒸蒸馏馏水水气泡气泡凝胶面凝胶面b加加样样：用用吸吸管管小小心心地地将将1mL透透析析后后的的样样品品加加到到色色谱谱柱的柱的顶顶端，注意不要破坏凝胶面。端，

11、注意不要破坏凝胶面。c加加样样后：打开下端出口，使后：打开下端出口，使样样品渗入凝胶床内品渗入凝胶床内.洗洗脱脱：加加入入_，打打开开下下端端出出口口，进进行行洗脱。洗脱。4纯纯度度鉴鉴定定：在在鉴鉴定定的的方方法法中中，使使用用最最多多的的是是SDS聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳。泳。五、操作提示五、操作提示1红细红细胞的洗胞的洗涤涤：洗：洗涤涤次数、次数、_与离心与离心时时间间十分重要。洗十分重要。洗涤涤次数次数过过少，无法除去血少，无法除去血浆浆蛋白：蛋白：离心速度离心速度过过高和高和时间过长时间过长会使会使_等一同沉淀，等一同沉淀，达不到分离效果。达不到分离效果。磷酸磷酸缓缓冲液冲

12、液离心速度离心速度白白细细胞胞2色色谱谱柱柱填填料料的的处处理理：商商品品凝凝胶胶使使用用前前需需直直接接放放在在洗洗脱脱液液中中膨膨胀胀，可可以以将将加加入入其其中中的的湿湿凝凝胶胶用用_加加热热，加速膨，加速膨胀胀。3凝凝胶胶色色谱谱柱柱的的装装填填：在在装装填填凝凝胶胶柱柱时时，不不得得有有气气泡泡存存在在。气气泡泡会会搅搅乱乱洗洗脱脱液液中中蛋蛋白白质质的的洗洗脱脱次次序，降低分离效果。序，降低分离效果。4蛋白蛋白质质的分离：如果的分离：如果红红色区色区带带_地移地移动动，说说明色明色谱谱柱制作成功。柱制作成功。沸水浴沸水浴均匀一致均匀一致核心要点突破核心要点突破要点一要点一解读实验原

13、理解读实验原理1蛋白蛋白质质分子在凝胶中的运分子在凝胶中的运动动情况分析情况分析相相对对分子分子质质量大量大相相对对分子分子质质量小量小直径大小直径大小大于凝胶大于凝胶颗颗粒空隙直粒空隙直径径小于凝胶小于凝胶颗颗粒空隙直粒空隙直径径运运动动方式方式垂直向下运垂直向下运动动无无规则规则的的扩扩散运散运动动运运动动速度速度较较快快较较慢慢运运动动路程路程较较短短较长较长洗脱次序洗脱次序先从凝胶柱中洗脱出先从凝胶柱中洗脱出来来后从凝柱中洗脱出来后从凝柱中洗脱出来2.电电泳方法泳方法琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电电泳泳聚丙聚丙烯酰烯酰胺凝胶胺凝胶电电泳泳由于由于琼琼脂糖本身不脂糖本身不带电带电荷，各种分子在荷

14、，各种分子在电场电场中中迁移速率决定于所迁移速率决定于所带电带电荷性荷性质质的差异及分子的的差异及分子的大小、形状不同大小、形状不同在凝胶中加入在凝胶中加入SDS，使，使蛋白蛋白质质解聚成解聚成单链单链，与，与各种蛋白各种蛋白质质形成蛋白形成蛋白质质SDS复合物，使其迁复合物，使其迁移速率完全取决于分子移速率完全取决于分子的大小的大小(2011年年聊聊城城高高二二检检测测)有有关关凝凝胶胶色色谱谱法法和和电电泳法的泳法的说说法正确的是法正确的是()A它它们们都是分离蛋白都是分离蛋白质质的重要方法的重要方法B它它们们的原理相同的原理相同C使使用用凝凝胶胶色色谱谱法法需需要要使使用用缓缓冲冲溶溶液

15、液而而电电泳泳不不需需要要D以上以上说说法都正确法都正确【尝试尝试解答解答】_A_例例例例1 1【解解析析】凝凝胶胶色色谱谱法法是是根根据据相相对对分分子子质质量量的的大大小小分分离离蛋蛋白白质质的的一一种种有有效效方方法法；电电泳泳法法是是利利用用待待测测样样品品中中各各种种分分子子带带电电性性质质的的差差异异和和分分子子本本身身的的大大小小、形形状状不不同同，使使带带电电分分子子产产生生不不同同的的迁迁移移速速度度，从从而而实实现现样样品品中中各各种种分分子子的的分分离离。这这两两种种方方法都用到法都用到缓缓冲溶液，以冲溶液，以调节调节溶液的酸碱度。溶液的酸碱度。【误误区区警警示示】不不同

16、同的的蛋蛋白白质质在在凝凝胶胶色色谱谱中中有有三三种运种运动动情况：情况：(1)分子很小，可分子很小，可进进入凝胶全部内孔隙；入凝胶全部内孔隙；(2)分子很大，完全不能分子很大，完全不能进进入凝胶的任何内孔隙；入凝胶的任何内孔隙；(3)分子大小适中，能分子大小适中，能进进入凝胶内孔隙中孔径大小入凝胶内孔隙中孔径大小相相应应部分。部分。跟跟踪踪训训练练下下列列各各项项中中，一一般般不不影影响响凝凝胶胶色色谱谱法法分离蛋白分离蛋白质质的分离度的是的分离度的是()A层层析柱的高度析柱的高度B层层析柱的直径析柱的直径C缓缓冲溶液冲溶液D样样品的分布品的分布解析：解析：选选B。分离度取决于柱高，。分离度

17、取决于柱高，为为分离不同分离不同组组分，凝胶柱必分，凝胶柱必须须有适宜的高度，分离度与柱高的有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关。平方根相关。样样品的分布也影响分离度，品的分布也影响分离度，缓缓冲溶冲溶液的液的pH影响蛋白影响蛋白质质所所带带的的电电荷，因此也影响分离荷，因此也影响分离度。只有度。只有层层析柱的直径一般不会影响分离度。析柱的直径一般不会影响分离度。要点二要点二血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离蛋蛋白白质质的的提提取取和和分分离离一一般般分分四四步步：样样品品处处理理粗分离粗分离纯纯化化纯纯度度鉴鉴定。定。1样样品品处处理理(1)红细红细胞的洗胞的洗涤涤采采集集血血样样低

18、低速速短短时时间间离离心心吸吸取取血血浆浆盐盐水洗水洗涤涤低速离心低速离心重复重复步步骤骤三次。三次。特特别别提醒提醒(1)洗洗涤涤红红细细胞胞的的目目的的是是去去除除杂杂蛋蛋白白，以以利利于于后后续续步步骤骤的的进进行。行。(2)离离心心时时转转速速要要低低，时时间间要要短短，一一般般为为500r/min，离心，离心2min。(3)洗洗涤涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤涤次次数。数。特特别别提醒提醒(1)将将试试管管中中的的液液体体用用滤滤纸纸过过滤滤，除除去去脂脂溶溶性性沉沉淀淀层层。(2)将将滤滤液于分液漏斗中静置片刻后，分出下液于分液漏斗中静置片

19、刻后，分出下层层的的血血红红蛋白水溶液蛋白水溶液层层。(4)透析透析取取1mL的的血血红红蛋蛋白白溶溶液液装装入入透透析析袋袋中中，将将透透析析袋袋放放入入盛盛有有300mL的的物物质质的的量量浓浓度度为为20mmol/L的的磷磷酸酸缓缓冲冲液液中中(pH为为7.0)，透透析析12h。目目的的是是除除去去样样品中相品中相对对分子分子质质量量较较小的小的杂质杂质。2凝胶色凝胶色谱谱操作操作(1)凝胶色凝胶色谱谱柱的制作柱的制作取取长长40cm，内内径径为为1.6cm的的玻玻璃璃管管，两两端端需需用用砂砂纸纸磨平。磨平。底底塞塞的的制制作作：打打孔孔挖挖出出凹凹穴穴安安装装移移液液管管头头部部覆盖

20、尼覆盖尼龙龙网，再用网，再用100目尼目尼龙纱龙纱包好。包好。顶顶塞的制作：打孔塞的制作：打孔安装玻璃管。安装玻璃管。组组装：将上述三者按相装：将上述三者按相应应位置位置组组装成一个整体。装成一个整体。安装其他附属安装其他附属结结构。构。特特别别提醒提醒底底塞塞中中插插入入的的玻玻璃璃管管的的上上部部不不得得超超出出橡橡皮皮塞塞的的凹凹穴穴底底面面，否否则则难难以以铺铺实实尼尼龙龙网网，还还会会导导致液体残留，蛋白致液体残留，蛋白质质分离不分离不彻彻底。底。(2)凝凝胶胶色色谱谱柱柱的的装装填填(本本实实验验使使用用的的凝凝胶胶是是交交联联葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶)固定：将色固定：将色谱谱柱垂直固

21、定在支架上柱垂直固定在支架上装填：将凝胶装填：将凝胶悬悬浮液一次性装填入色浮液一次性装填入色谱谱柱内柱内洗洗涤涤：用磷酸：用磷酸缓缓冲液充分洗冲液充分洗涤涤平衡凝胶平衡凝胶12h(3)样样品的加入和洗脱品的加入和洗脱调调整整缓缓冲液面：与凝胶面平冲液面：与凝胶面平齐齐滴加透析滴加透析样样品：用量品：用量为为1mL样样品渗入凝胶床：品渗入凝胶床：样样品完全渗品完全渗进进凝胶凝胶层层洗脱：打开下端出口，用磷酸洗脱：打开下端出口，用磷酸缓缓冲液洗脱冲液洗脱收集：待收集：待红红色的蛋白色的蛋白质质接近色接近色谱谱柱底端柱底端时时，用，用试试管收集流出液，每管收集流出液，每5mL收集一管，收集一管，连续

22、连续收集收集特特别别提醒提醒(1)滴滴加加样样品品时时，吸吸管管管管口口贴贴着着管管壁壁环环绕绕移移动动加加样样，同同时时注意不要破坏凝胶面。注意不要破坏凝胶面。(2)在蛋白在蛋白质质分离分离过过程中，仔程中，仔细观细观察察红红色区色区带带在洗脱在洗脱过过程中的移程中的移动动情况。如果情况。如果红红色区色区带带均匀一致的移均匀一致的移动动，说说明色明色谱谱柱制作成功。柱制作成功。下下面面是是凝凝胶胶色色谱谱法法分分离离血血红红蛋蛋白白时时样样品品的的加加入入(图图)和和洗洗脱脱(图图)示示意意图图，请请据据图图回回答答下下列列问题问题。例例例例2 2(1)在在 加加 样样 示示 意意 图图 中

23、中，正正 确确 的的 加加 样样 顺顺 序序 是是_。(2)用用 吸吸 管管 加加 样样 时时，应应 注注 意意 正正 确确 操操 作作，分分 别别 是是_、贴贴着着管管壁壁加加样样、_。(3)等等样样品品_时时，才加入，才加入缓缓冲液，待冲液，待_接近色接近色谱谱柱底端柱底端时时，用，用试试管收集流出液，每管收集流出液，每_mL收集一管，收集一管，连连续续收集。收集。【尝试尝试解答解答】(1)(2)不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁不要破坏凝胶面使吸管管口沿管壁环绕环绕移移动动(3)完全完全进进入凝胶入凝胶层层红红色的蛋白色的蛋白质质5【解析解析】加加样样品品时应严时应严格按要求格按要求进进行操

24、作，吸行操作，吸管管应贴应贴着管壁，管口沿着管壁着管壁，管口沿着管壁环绕环绕移移动动，还应还应注注意不要破坏凝胶面。等意不要破坏凝胶面。等样样品完全品完全进进入到凝胶入到凝胶层时层时，才加入才加入缓缓冲液冲液进进行洗脱。行洗脱。【探探规寻规寻律律】对对分离效果的判断分离效果的判断(1)若若血血红红蛋蛋白白的的红红色色区区带带均均匀匀、狭狭窄窄、平平整整地地随随洗脱液洗脱液缓缓慢流出，慢流出，则则装填成功，分离操作正确。装填成功，分离操作正确。(2)若血若血红红蛋白的蛋白的红红色区色区带带歪曲、散乱、歪曲、散乱、变宽变宽，则则说说明分离效果不好，装填不成功。明分离效果不好，装填不成功。【互互动动

25、探探究究】(1)凝凝胶胶色色谱谱柱柱的的装装填填应应注注意意哪哪些些事事项项？(2)血血红红蛋白溶液是如何分离的？蛋白溶液是如何分离的？【提提示示】(1)装装填填前前为为了了加加速速膨膨胀胀，可可以以加加入入洗洗脱脱液液的的湿湿凝凝胶胶，用用沸沸水水浴浴加加热热，优优点点是是：节节约约时时间间，除除去去凝凝胶胶中中可可能能带带有有的的微微生生物物，排排除除胶胶粒粒内的空气。内的空气。装装填填时时不不能能有有气气泡泡，气气泡泡会会搅搅乱乱洗洗脱脱液液中中蛋蛋白白质质的洗脱次序，降低分离效果。的洗脱次序，降低分离效果。装填后不能装填后不能发发生洗脱液流干露出凝胶生洗脱液流干露出凝胶颗颗粒的粒的现现

26、象。象。(2)蛋蛋白白质质的的分分离离是是根根据据离离心心原原理理进进行行的的。当当含含有有细细小小颗颗粒粒的的悬悬浮浮液液静静置置不不动动时时，由由于于重重力力场场的的作作用用使使得得悬悬浮浮的的颗颗粒粒逐逐渐渐下下沉沉。粒粒子子越越重重，下下沉沉越越快快，反反之之密密度度比比液液体体小小的的粒粒子子就就会会上上浮浮。微微粒粒在在重重力力场场下下移移动动的的速速度度与与微微粒粒的的大大小小、形形态态和和密密度度有有关关，并并且且又又与与重重力力场场的的强强度度及及液液体体的的黏黏度度有有关关。像像红红细细胞胞大大小小的的颗颗粒粒，直直径径为为数数微微米米，就就可可以以在在通通常常重重力力作作用用下下观观察到它察到它们们的沉降的沉降过过程。程。