《分子生物学》PPT课件.pptx

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1、LOGORNARNA的转录合成的转录合成-真核生物的真核生物的RNARNA转录转录专专 业：生物技术业：生物技术院院 系：生命科学学院系：生命科学学院2023/1/30vMultiple forms of eukaryotic RNA pol.vMore promotersvEnhancers,silencers etc cis-elements andvtrans-fators 真核基因真核基因转录的特点的特点v单顺反子反子v聚合聚合酶高度分工高度分工vTrans-factorsvCis-elementsv真核基因的真核基因的转录以正以正调控控为主。主。真核生物的真核生物的RNA聚合酶聚合酶

2、三种不同的三种不同的RNA聚合酶聚合酶根据它们对根据它们对-鹅膏蕈碱（鹅膏蕈碱（-amanitin）的敏感性不同分为的敏感性不同分为RNA聚合酶聚合酶I、II、III。对抑制物的敏感性对抑制物的敏感性 酶的种类酶的种类 对高浓度对高浓度-鹅膏蕈碱敏感鹅膏蕈碱敏感 RNA聚合酶聚合酶III 对低浓度对低浓度-鹅膏蕈碱敏感鹅膏蕈碱敏感 RNA聚合酶聚合酶II 对对-鹅膏蕈碱不敏感鹅膏蕈碱不敏感 RNA聚合酶聚合酶I 定位及产物定位及产物Polymerase II makes Heterogeneous nuclear RNA(hnRNA)RNA polymerase in Eukaryotes R

3、NApol.I,II,III L with 78%homologous between 3 RNApol.I,II,IIIL of prokaryote RNApol.(功能相似功能相似)Including L,L subunit&7-12 small subunits RNApol II(B);-For pre-mRNA transcription -Located in nucleoplasm -L maximum subunit 240 kd&have specific COOH-end named CTD (Carboxyl Terminal Domain)only in RNApol

4、 II -CTD-end;7aa repeats&high frequency phosphorylation TyrSerPProThrPSerPProSerP Yeast 26XDrosophila 44X repeat unit of 7 aa/in CTDRat&Human 52X vCTD中的中的 Ser和和 Thr可被高度磷酸化，并且可逆。可被高度磷酸化，并且可逆。v磷酸化磷酸化的的 RNApol 被称为被称为Av非磷酸化非磷酸化的的 RNApol 称为称为BvCTD参与转录参与转录 B A 使使RNApol易于离开易于离开v启动子进入延伸过程（启动子进入延伸过程（10倍）倍）去去

5、磷酸化的磷酸化的RNA II pol（B）在）在转录起始时结合转录起始时结合于启动子，磷酸化的于启动子，磷酸化的RNA II pol(A)在在延伸过程延伸过程中有作用。中有作用。v定定义：RNA聚合聚合酶和基本和基本转录因子（因子（bTF）的的结合区域，它合区域，它们共同共同组装成装成转录起始复合起始复合物。物。PromotersvThree eukaryotic RNA polymerases have:Different structuresTranscribe different classes of genesvExpect that the 3 polymerases would r

6、ecognize different promotersClass II PromotersvPromoters recognized by RNA polymerase II(class II promoters)are similar to prokaryotic promotersvhave two parts:Core promoter having 4 elementsUpstream promoter element UPECore Promoter Elements TATA BoxvTATA box Found on the nontemplate strandVery sim

7、ilar to the prokaryotic-10 boxThere are frequently TATA-less promotersHousekeeping genes that are constitutively active in nearly all cells as they control common biochemical pathwaysDevelopmentally regulated genes Core Promoter ElementsvIn addition to TATA box,core promoters are:TFIIB recognition e

8、lement(BRE)Initiator(Inr)Downstream promoter element(DPE)vAt least one of the four core elements is missing in most promotersvTATA-less promoters tend to have DPEs and have GC box to compensate for the lack of TATA boxvPromoters for highly specialized (luxury)genes tend to have TATA boxes vPromoters

9、 for housekeeping genes tend to lack themvTATA区主要作用是使转录精确起始，如果该区主要作用是使转录精确起始，如果该区缺失或发生突变则导致转录起始位点不确定。区缺失或发生突变则导致转录起始位点不确定。v在二类启动子里，在二类启动子里，TATA box是转录起始复合是转录起始复合体蛋白组装的位置。第一个结合在该位点的蛋体蛋白组装的位置。第一个结合在该位点的蛋白是白是TBP，当其结合后，会增加其他转录因子，当其结合后，会增加其他转录因子结合的几率。结合的几率。Upstream ElementsvUpstream promoter elements are

10、 usually found upstream of class II core promotersvGC boxes bind transcription factor Sp1-110-80vCCAAT boxes bind CTF(CCAAT-binding transcription factor)-80-70vUpstream promoter elements can be orientation-independent,yet are relatively position-dependentATATAACCAATGCCACACCC 或或GGGCGGG+1转录起点起点TATA bo

11、xCAAT boxGC box增增强子子-35 -25-80 -70-110 -80 promoter model(RNA Pol II)vGC box可能有多个，如果发生突变或者缺可能有多个，如果发生突变或者缺失，则会对活性有很大影响，比如失，则会对活性有很大影响，比如SV40 early gene具有具有6个个GC box，丢失，丢失1个活性只个活性只有有33%，丢，丢2个则有个则有13%，3个则无活性个则无活性vGC box具有位置依赖性，但没有方向依赖具有位置依赖性，但没有方向依赖性。如果离开性。如果离开TATA box 太远则不起作用。太远则不起作用。vCCAAT区和区和GC区主要控

12、制转录起始频率，区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。基本不参与起始位点的确定。CAAT区域任何区域任何碱基改变对转率起始频率和强度影响都很大。碱基改变对转率起始频率和强度影响都很大。另外在另外在TATA区和区和UPE区域插入核苷酸序列也区域插入核苷酸序列也会降低活性。这会降低活性。这2个区域方向对于转录的影响个区域方向对于转录的影响不大。不大。Class I PromotersvClass I promoters are not well conserved in sequence across speciesvGeneral architecture of the promot

13、er is well conserved two elements:Core element surrounding transcription start siteUpstream control element(UCE)100 bp farther upstreamSpacing between these elements is importantRNA pol promoter+1+6-31-100-100UCE:5080bpCore promoterPre-rRNA geneEnhance transcriptionEssential for transcriptionClass I

14、II PromotersvRNA polymerase III transcribes a lot of short genesvThese have promoters that lie wholly within the genesvThere are 3 types of these promotersPromoters of Some Polymerase III GenesvType I(5S rRNA)has 3 regions:Box AShort intermediate elementBox CvType II(tRNA)has 2 regions:Box A Box BvT

15、ype III(nonclassical)U6 snRNA基因基因基本基本转录因子因子bTFv组成型成型转录因子因子v广泛的广泛的DNA结合蛋合蛋白白v一般是一般是针对pol II催催化化转录必需必需TFRNA聚合酶聚合酶II 的转的转录因子录因子：作用于作用于TATA框的转录因子至少框的转录因子至少有有 7种，即种，即TAIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和、和TFIIJ。TFIID：TBP TATA-binding protein，+TAFsTBP相关因子（相关因子（TBPassociated factors,TAF）RNA聚合酶聚合酶I的转录因子的转录因

16、子需要两种转录因子需要两种转录因子 上游结合因子上游结合因子（upstream binding factor,UBF）选选择择因因子子1（SL1）4种种蛋蛋白白质质组组成成，包包括括TATA框框结结合合蛋蛋白（白（TATA-binding protein，TBP）UBF：特特异异地地识识别别核核心心启启动动子子和和上上游游调调控控元元件件（UCE）中富含中富含GC对的区域。对的区域。SL1：单单独独并并没没有有识识别别特特异异DNA序序列列的的功功能能，在在UBF和和DNA结合后，结合后，SL1才可结合上来。才可结合上来。只只有有当当两两种种辅辅助助因因子子与与DNA结结合合后后，RNA聚聚合

17、合酶酶I才才能能与核心启动子结合，从而起始转录。与核心启动子结合，从而起始转录。Initiation of pol genes transcriptionUBFUBFSL1POL NOTE:UBF-upstream binding factor SL1-selectivity factor RNApol 的转的转录因子录因子 两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子 TFA 一种含一种含9个锌指结构的蛋白个锌指结构的蛋白 TFB 由由TBP和和BRT、B”等蛋白构成等蛋白构成 TFC 至少至少5个亚基以上个亚基以上 TFB和和TFC是几类是几类RNApo

18、l 共同需要的转录因子共同需要的转录因子 TFIIIA因子主要是针对因子主要是针对5S rRNA的转录来讲常用。的转录来讲常用。TFB是真正的转录起始因子，是真正的转录起始因子，A和和C仅仅是组装因子，作仅仅是组装因子，作 用是协助用是协助TFIIIB的定位。的定位。一般模式The Role of TBP 三种三种RNApol 的转录起始均需要的转录起始均需要TBP 所有所有 RNApol 的转录起始都需要的转录起始都需要TBP 在在 RNApol的转录起始过程中的转录起始过程中,TBP是是SL1的的 组份，起定位组份，起定位RNApol的作用的作用 RNApol的转录起始由的转录起始由TBP

19、识别识别TATA框框 TBP 起定位作用起定位作用,所以又称定位因子所以又称定位因子（positioning factor）Specificity of TBP depends on associated TAFsDNA 结合域果蝇克隆基因产物组装的果蝇克隆基因产物组装的TFIIDRNA polymerases are positioned at all promoters by a factor that contains TBP.TBP is a universal factorTBP非常保守，非常保守，TATA box结合域位于其结合域位于其C端，端，富含碱性氨基酸，富含碱性氨基酸，N端

20、分化很大可结合很多端分化很大可结合很多TAFs。TBP结合于结合于TATA框小沟，含有框小沟，含有TATA box的启的启动子需要动子需要TBP，不含，不含TATA box的启动子也需的启动子也需要要TBP。vThe TAFII250 and TAFII150 help the TFIID bind to the initiator and DPE of promotersvAlso aid in TFIID interaction with Sp1 that is bound to GC boxes upstream of the transcription start sitevThey

21、enable TBP to bind to:TATA-less promoters that contain elements such as a GC box -RNApol II +20TFIIs 逐级组装逐级组装 TIC 转录启动转录启动 (Transcriptional Initiation Complex)TBP Control UPE（upstream promoter elements）effect for basic transcriptionTFIID：A sort of protein complex(TBP&8 TAF)II类基因转录起始复合物的组装及起始类基因转录起始复

22、合物的组装及起始TATA +1 Wilds minor groove TFII A TBP of D pre-TIC TFIIA：Binds to TFII D Enhances TFII D binding to TATA box Stabilizing the DNA-TFII D complex TFII B Basic TIC TFIIB;Once TFIID has bound to DNA,TFIIB binds to TFIID and binds to TBP of TFIID and RNA pol.II TFIIF;Including two subunits of RAP

23、30,RAP74 Binding and recruiting RNApol II to assemble TIC Promoting RNA elongation by its helicase(ATPase)A,DTFII FRNApol IITFIIH;Large complex made up of 5 subunits Helicase activity(ATPase)&kinase activity Phosphorylation of CTD of RNApol IIO DNA repair TFIIE;Associate with TFIIH kinase complete T

24、IC EHmRNA Promoter clearance E H B D ATATA +1 Wilds minor groove TFII A TBP of D pre-TIC TFII F RNApol IITFII B Basic TIC conclusionmRNA Promoter clearance E H B D ATranscription startingcomplete TIC EHRNA聚合酶聚合酶II的延伸因子的延伸因子vTFIIsvRNA聚合酶并非以固定速率转录，有时会在某地暂停，TFIIs的作用可能是限制RNA聚合酶的暂停，促进转录延伸。v促进RNA聚合酶的校对功能。

25、RNA聚合酶聚合酶II的转录激活因子的转录激活因子v通用转录因子只能低水平的起始转录，激活因子对于转录起始频率和基因的时空表达都有调节作用。Enhancers and SilencersvThese are position-and orientation-independent DNA elements that stimulate or depress,respectively,transcription of associated genesvAre often tissue-specific in that they rely on tissue-specific DNA-bindin

26、g proteins for their activitiesvSome DNA elements can act either as enhancer or silencer depending on what is bound to it例例v识别CAAT box的一系列因子称为CTF家族。海胆的卵中，组蛋白基因H2B启动子中含有2个CAAT box，这个基因仅仅在精子发生时表达。而从睾丸和胚胎中都有CAAT结合蛋白可以分离，却只有睾丸中的CAAT结合蛋白才能结合CAAT box，胚胎中则不行。原因在于睾丸内CTF因子可以激活H2B基因转录，而胚胎中的CTF因子被CDP（CAAT取代蛋白）

27、抢先占据了启动子位置，阻止了起始复合物的组装，导致转录无法进行。增强增强子子 位于启动子上游或下游甚至基因内的一位于启动子上游或下游甚至基因内的一段段DNA顺序，它可以增强启动子发动转录顺序，它可以增强启动子发动转录的作用，从而明显地提高基因转录的效率。的作用，从而明显地提高基因转录的效率。增强子的功能及作用特点增强子的功能及作用特点1）能能远距离远距离增强启动子的活性；增强启动子的活性；2）在启动子的上游和下游均起作用在启动子的上游和下游均起作用；3）无方向性；无方向性；4）对启动子的影响无严格的专一性。对启动子的影响无严格的专一性。vActivators can stimulate or

28、inhibit transcription by RNA polymerase IIvThe structure of them is composed of at least 2 functional domainsDNA-binding domainTranscription-activation domainMany also have a dimerization domainActivatorsDNA-Binding DomainsvDNA-binding domains have DNA-binding motifPart of the domain having characte

29、ristic shape specialized for specific DNA bindingMost DNA-binding motifs fall into 3 classes1st Zinc fingervThere are at least 3 kinds of zinc-containing modules that act as DNA-binding motifsvAll use one or more zinc ions to create a shape to fit an a-helix of the motif into the DNA major groovev在进

30、行TFIIIA和几种其它的DNA结合蛋白的氨基酸序列分析时，发现相同的、重复的氨基酸序列。这个大约含有30个氨基酸的序列折叠成一种包含四面体配位的锌离子的结构，这样的结构称之锌指v锌指目前发现了三种：Cys2/His2 型、Cys2/Cys2型和2锌离子型vZn位于Cys2和His2组成的四面体中v单个锌指的三维结构是由一个螺旋和一个折叠片组成的 a螺旋与DNA双螺旋的大沟接触来调控转录vCys2/His2 型共有序列为：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-5HisvCys2/Cys2型共有序列为：CysX2-CysX1-3-CysX2 Cysv酵母的GA

31、L4型蛋白：6个Cys和2个Zn，与大沟结合，二聚化位点紧邻DNA结合域成a螺旋。v并非所有锌指蛋白都是DNA结合蛋白，有些则可与RNA结合，有些则没有任何关系。2nd helix-turn-helixv同源异型域，一类DNA序列编码60个氨基酸，几乎在所有真核生物中都有。v含有3个a螺旋，第2，3个螺旋成h-t-h型结构3rd bZIP and bHLH MotifsvA number of transcription factors have a highly basic DNA-binding motif linked to protein dimerization motifsLeuc

32、ine zippersHelix-loop-helixvExamples include:CCAAT/enhancer-binding proteinMyoD proteinv一个HLH结构是由一个短的-螺旋通过一个环与另一个长的-螺旋组成的。vHLH二聚体也有亮氨酸拉链区，两个HLH可以是相同的（形成同源二聚体），也可以不同（形成异源二聚体）。但与DNA结合的是从二聚合区分开的两个含有许多碱性氨基酸残基的-螺旋。v缺少与DNA结合所需要的碱性区蛋白是bHLH活性的显性失活阻遏物（dn-HLH）。Leucine zippersv许多转录因子常常是以二聚体的形式识别和结合DNA的靶位点v这种二聚

33、体一部分是疏水区，另一部分是亲水区，可以说是一种“兼性”的二聚体。v疏水区是两个相同-螺旋序列靠疏水相互作用彼此缠绕形成的二聚体区。亲水区是负责与DNA结合的部分，这部分是分开的两个-螺旋，螺旋中含有很多碱性氨基酸残基。整个二聚体结构象一个倒置的Y疏水区中的两个疏水区中的两个-螺旋序列的最大特螺旋序列的最大特点是螺旋中每隔点是螺旋中每隔6个氨基酸残基就出个氨基酸残基就出现一个亮氨酸残基，由于现一个亮氨酸残基，由于-螺旋中每螺旋中每一转含有一转含有3.4个氨基酸残基，所以第个氨基酸残基，所以第7个氨基酸残基基本上是处于螺旋的同个氨基酸残基基本上是处于螺旋的同一侧面，这样的相邻一侧面，这样的相邻-

34、螺旋中的亮氨螺旋中的亮氨酸残基侧链都伸向对方，亮氨酸侧链酸残基侧链都伸向对方，亮氨酸侧链象两手手指那样交叉锁住，提供了可象两手手指那样交叉锁住，提供了可将两个将两个-螺旋结合在一起的疏水堆积螺旋结合在一起的疏水堆积相互作用。相互作用。Functions of ActivatorsvBacterial core RNA polymerase is incapable of initiating meaningful transcriptionvRNA polymerase holoenzyme can catalyze basal level transcriptionOften insuffi

35、cient at weak promotersCells have activators to boost basal transcription to higher level in a process called recruitment(补偿作用)Eukaryotic ActivatorsvEukaryotic activators also recruit RNA polymerase to promotersvStimulate binding of general transcription factors and RNA polymerase to a promoterInter

36、action Among ActivatorsvGeneral transcription factors must interact to form the preinitiation complexvActivators and general transcription factors also interactvActivators usually interact with one another in activating a geneIndividual factors interact to form a protein dimer facilitating binding t

37、o a single DNA target siteSpecific factors bound to different DNA target sites can collaborate in activating a geneDimerizationvDimerization is a great advantage to an activatorvDimerization increases the affinity between activator and its DNA targetvSome activators form homodimersvHeterodimers are also formed