《免疫组织化学》PPT课件.ppt

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1、免免疫疫组组织织化化学学Immunohistochemistry(IHC)第一章第一章免疫组织化学基本原理免疫组织化学基本原理及相关知识及相关知识 用标记的抗体（或抗原）对细胞或组用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应位或定量检测，经过组织化学的显色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。之后，用显微镜、荧光显微镜或电镜观察。蛋白质蛋白质磷脂磷脂多肽多肽多糖多糖核酸核酸受体受体酶酶病原体病原体激素激素免疫组织化学技术的突出优点：免疫组织化学技术的突出优点：高度的特异性高度的特异性敏感性高敏感

2、性高方法步骤统一方法步骤统一机能和代谢密切结合，机能和代谢密切结合，定性、定位、定量的统一定性、定位、定量的统一 免疫组织化学技术在细胞、染色免疫组织化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替是其它任何生物技术难以达到和代替的。它能在细胞、基因和分子水平同的。它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。拓了广阔的前景。基因探针基因探

3、针核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术原位原位PCR技术技术核酸杂交和免疫组织化学双标记核酸杂交和免疫组织化学双标记电镜杂交技术电镜杂交技术核酸分子探针核酸分子探针-杂交杂交-免疫组织化学免疫组织化学放大和显示杂交信号放大和显示杂交信号杂交免疫组织化学杂交免疫组织化学基因重组技术基因重组技术免疫组织化学免疫组织化学图像分析图像分析单抗技术单抗技术技技术术流式细胞术流式细胞术激光共聚焦显微术激光共聚焦显微术免疫组织化学的全过程：免疫组织化学的全过程：1.抗原的提取和纯化抗原的提取和纯化2.免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）3.抗体效价检测和提取、纯化抗体效价检测和提取、

4、纯化4.标记抗体标记抗体5.细胞、组织切片标本的制备细胞、组织切片标本的制备6.免疫组织化学反应和显色免疫组织化学反应和显色7.观察和记录结果观察和记录结果第二章第二章 免疫组织化学中的技术问题免疫组织化学中的技术问题技术问题的重要性技术问题的重要性第一节第一节有关的细胞和组织学技术有关的细胞和组织学技术一、取材一、取材（一）细胞标本的取材（一）细胞标本的取材印片法印片法穿刺吸取涂片法穿刺吸取涂片法体液沉淀涂片法体液沉淀涂片法细胞数量多：直接涂片细胞数量多：直接涂片细胞数量少：离心沉淀涂片细胞数量少：离心沉淀涂片培养细胞培养细胞直接收集直接收集培养液离心涂片培养液离心涂片（二）组织标本的取材（

5、二）组织标本的取材活检钳的刀口必须锋利，以免组织受活检钳的刀口必须锋利，以免组织受挤压挤压取材部位必须是主要病变区取材部位必须是主要病变区必须取病灶与正常组织交界处必须取病灶与正常组织交界处必要时取远离病灶区的正常组织作对必要时取远离病灶区的正常组织作对照照新鲜组织新鲜组织冰冻切片冰冻切片液氮保存液氮保存-70冰箱冰箱二、固定二、固定固定剂：常用醛类固定剂固定剂：常用醛类固定剂10%福尔马林（甲醛福尔马林（甲醛10ml+蒸馏水蒸馏水90ml）10%中性缓冲福尔马林（甲醛中性缓冲福尔马林（甲醛10ml+0.01mol/LpH7.4PBS90ml）2.5%戊二醛戊二醛用于电镜用于电镜丙酮丙酮用于冰

6、冻切片、细胞涂片用于冰冻切片、细胞涂片4固定方法：固定方法：浸入法浸入法灌注法灌注法三、切片三、切片1.石蜡切片石蜡切片2.冰冻切片冰冻切片3.塑料切片塑料切片4.超薄切片超薄切片四四.玻片处理和涂胶玻片处理和涂胶载玻片和盖玻片处理载玻片和盖玻片处理盖玻片、载玻片盖玻片、载玻片清洁液中浸泡清洁液中浸泡24h（硫酸（硫酸+重铬酸钾）重铬酸钾）清水冲洗清水冲洗蒸馏水冲洗蒸馏水冲洗95%酒精浸泡酒精浸泡24h烘干烘干载玻片涂粘附剂载玻片涂粘附剂:APES多聚赖氨酸多聚赖氨酸第二节第二节免疫组化染色中的技术问题免疫组化染色中的技术问题一、抗体一、抗体新制备或购进的是原液或冻干品，抗血新制备或购进的是原

7、液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清或腹水。清为全血清，单克隆抗体是培养上清或腹水。1.抗体贮存抗体贮存2.抗体稀释抗体稀释按不同的免疫染色方法和按不同的免疫染色方法和抗原性强弱及抗原的多少，稀释各种抗体抗原性强弱及抗原的多少，稀释各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色效果。原液，以便获得最佳免疫染色效果。抗体最佳稀释度的测定方法抗体最佳稀释度的测定方法二抗二抗一一抗抗11:501:1001:2001:400_1:50+1:100+1:200+1:400_以中等阳性稀释度为佳以中等阳性稀释度为佳抗体稀释液的配制抗体稀释液的配制 0.01mol/LpH7.4PBSorTBS 3抗体的选择

8、抗体的选择(1)多抗：虽然存在交叉反应的问题，多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。验结果，这是多抗的优点之一。(2)单抗：识别单个抗原表位，所以特单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一。一。多抗？单抗？多抗？单抗？抗原表位的丰富程度抗原表位的丰富程度也可应用多个单抗也可应用多个单抗（acoc

9、ktailofmonoclonalantibodies）解决抗原表位少的问题解决抗原表位少的问题二、免疫染色二、免疫染色一般程序：一般程序：标记抗体与标本中的抗原反应结合标记抗体与标本中的抗原反应结合用用PBS洗去未结合的部分洗去未结合的部分直接观察结果（免疫荧光）或显色直接观察结果（免疫荧光）或显色后再用显微镜观察（免疫酶）后再用显微镜观察（免疫酶）1.增强特异性染色的方法增强特异性染色的方法蛋白酶消化法蛋白酶消化法胃蛋白酶、胰蛋白酶胃蛋白酶、胰蛋白酶合适的抗体稀释度合适的抗体稀释度第一抗体第一抗体温育时间温育时间3730-60min,4过夜过夜多层染色法（双层、三层）多层染色法（双层、三层

10、）2.减少或消除非特异性染色的方法减少或消除非特异性染色的方法加二抗动物的正常血清加二抗动物的正常血清2%5%牛血清白蛋白牛血清白蛋白3.显色反应的控制显色反应的控制显色剂的浓度、温育时间显色剂的浓度、温育时间4.复染复染三、对照三、对照阳性对照阳性对照阴性对照阴性对照阻断试验阻断试验替代对照替代对照空白对照空白对照自身对照自身对照吸收试验吸收试验四、免疫组织化学染色结果的判断四、免疫组织化学染色结果的判断阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、阳性细胞染色分布有三种类型：胞浆、胞核、细胞膜表面胞核、细胞膜表面阳性细胞分布可分为灶性或弥漫性阳性细胞分布可分为灶性或弥漫性由于细胞内抗原含量不同，所以染

11、色强由于细胞内抗原含量不同，所以染色强度不一度不一阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细阳性细胞染色定位于细胞，与阴性细胞相互交杂分布。胞相互交杂分布。切片边缘、刀痕或皱折区域切片边缘、刀痕或皱折区域、坏死或、坏死或挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常表现挤压的细胞区、胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。性。第三章第三章免疫组织化学常用方法介绍免疫组织化学常用方法介绍第一节第一节免疫酶细胞化学免疫酶细胞化学 免疫酶细胞化学是免疫组织化学中免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，它是在抗原抗体特异反最常用的方法，它是在抗原抗体特异反应存在的

12、前提条件下，借助于酶细胞化应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学手段，检测某种物质（抗原抗体）学手段，检测某种物质（抗原抗体）在组织细胞内的存在部位。即预先将抗在组织细胞内的存在部位。即预先将抗体与酶连结（酶标抗体），再使其与组体与酶连结（酶标抗体），再使其与组织内特异性抗原反应，经细胞化学染色织内特异性抗原反应，经细胞化学染色后，在光镜或电镜下观察分析。后，在光镜或电镜下观察分析。一、常用酶的种类一、常用酶的种类用于标记的酶应具备以下几点：用于标记的酶应具备以下几点：酶催化的的底物必须是特异性的，且容酶催化的的底物必须是特异性的，且容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电镜易被显示，所形成的产物

13、易于在光镜或电镜下观察。下观察。所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围组织弥散。围组织弥散。较易获得酶分子，最好有商品出售。较易获得酶分子，最好有商品出售。中性中性pH时，酶应稳定，酶标记抗时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存体后，保存12年活性不应改变。年活性不应改变。酶标过程中，酶与抗体连结，不能酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性。影响二者的活性。被检测组织中，不应存在与标记酶被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。相同的内源性酶或类似物质。免疫组织化学常用酶免疫组织化学常用酶名称名称分子量分子量内源性内源性商品商品HRP(POD)40

14、-50kD+有有ALP(AP)80-120kD+有有HRP/POD（辣根过氧化物酶）（辣根过氧化物酶）显色原理：显色原理：HRP+H2O2HRPH2O2+供氢体供氢体（电子供体）（电子供体）HRP+H2O+供氢体供氢体（氧化型）（氧化型）DAB（二氢基联苯胺）（二氢基联苯胺）棕褐色棕褐色AEC（3-氢氢-9-乙基咔唑）乙基咔唑）红色红色TMB（四甲基联苯氨）（四甲基联苯氨）深蓝色深蓝色ALP/AP（碱性磷酸酶）（碱性磷酸酶）底物：萘酚（底物：萘酚（As-Mx）发色团：发色团：FastBlueFastRedBCIP/NBT血细胞、淋巴细胞血细胞、淋巴细胞内源性过氧化酶含量较高内源性过氧化酶含量较

15、高可选用可选用ALP/AP二、染色步骤及原理二、染色步骤及原理间接法：间接法：1.石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水;2.未固定的冰冻切片，丙酮固定未固定的冰冻切片，丙酮固定2030min，风干，风干1530min;3.用用0.03%H2O2处理切片处理切片1530min(室温室温)，封闭内源性过氧化酶的活性；，封闭内源性过氧化酶的活性；4.PBS洗涤洗涤2min;5.0.05%Tween-20/PBS，5min（室温）；（室温）；6.0.1%-1%BSA湿盒内孵育湿盒内孵育1525min（室温），然后轻轻弃去孵育液（室温），然后轻轻弃去孵育液（不冲（不冲洗）

16、洗）；(或二抗动物的正常血清或二抗动物的正常血清);7.轻轻弃去孵育液，滴加轻轻弃去孵育液，滴加PBS稀释的第稀释的第一抗体，湿盒内孵育一抗体，湿盒内孵育12h（20-25）；）；8.PBS充分冲洗，充分冲洗，5min3次，以去除次，以去除切片上非特异性吸附的抗体；切片上非特异性吸附的抗体；9.滴加滴加PBS稀释的稀释的HRP标记的第二抗体，标记的第二抗体，湿盒内孵育湿盒内孵育4560min（室温）；（室温）；10.PBS漂洗漂洗5min3次；次；11.显色，显色，0.01%-0.1%H2O20.01%-0.05%DAB,1015min；12.细胞核复染（甲基绿或苏木素）；细胞核复染（甲基绿或

17、苏木素）；13.封片、观察、记录。封片、观察、记录。亲和组织化学（亲和组织化学（affinityhistochemistry）植物凝集素与糖类植物凝集素与糖类生物素与抗生物素生物素与抗生物素葡萄球菌葡萄球菌A蛋白与蛋白与IgG阳离子与阴离子阳离子与阴离子激素、维生素、糖类与受体激素、维生素、糖类与受体第二节第二节抗生物素抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法生物素免疫细胞化学染色法一、基本原理一、基本原理抗生物素（卵白素）抗生物素（卵白素）avidin分子量分子量68000糖蛋白糖蛋白生生物物素素（维生素（维生素H）biotin分子量分子量244 biotinavidinbiotinbiotinb

18、iotin二、抗生物素二、抗生物素-生物素生物素-过氧化酶复合物技术过氧化酶复合物技术(Avidin-Biotin-peroxidaseComplextechnique,ABC法法)其特点是利用抗生物素分别连接生物素标其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。记的第二抗体和生物素标记的酶。secondantibody-biotin+Avidin+biotin-HRPABCcomplex操作步骤：操作步骤：1.石蜡切片脱蜡，系列酒精至水；石蜡切片脱蜡，系列酒精至水；2.冰冻切片丙酮固定冰冻切片丙酮固定10min，PBS洗洗涤涤5min3；2.第一抗体，室温孵育第一抗体，室

19、温孵育60min；3.PBS洗涤洗涤5min3次次4.生物素标记的第二抗体，孵育生物素标记的第二抗体，孵育45min5.PBS洗涤洗涤5min3次次6.ABC复合物，复合物，45min7.PBS洗涤洗涤5min3次次8.显色（显色（H2O2/DAB）、）、复染、封片复染、封片9.观察、记录观察、记录secondantibody-biotin+Avidin+biotin-HRPABC复合物的配制：复合物的配制：biotin：avidin1：4avidin10g/mlbiotin2.5g/ml临用前临用前30分钟配制分钟配制ABC法特点：法特点：敏感性强，具有放大作用敏感性强，具有放大作用特异性强

20、，背景染色淡特异性强，背景染色淡方法简便，节约时间方法简便，节约时间由于生物素与抗生物素具有与多种示由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重染色踪物结合的能力，可用于双重或多重染色注意事项注意事项内源性生物素活性及其消除：肝、肾、内源性生物素活性及其消除：肝、肾、白细胞、乳腺预先以白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和抗生物素和0.01%生物素溶液分别作用生物素溶液分别作用20min，以消除内源性，以消除内源性生物素。生物素。试剂的差异，应进行预实验。试剂的差异，应进行预实验。ABC试剂盒保存以试剂盒保存以4为佳。为佳。第三节第三节葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A（SPA）葡

21、萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A（staphylococalprotein,SPA）是一种从金黄色葡萄球）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。菌细胞壁分离的蛋白质。早在早在1940年，年，Vevwey发现某些金黄发现某些金黄色葡萄球中，含有一种物质，在双向扩色葡萄球中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀，散试验中能与正常人血清形成沉淀，1959年将其命名为年将其命名为A抗原。抗原。一、免疫学特性一、免疫学特性SPA具有与人及多种动物（豚鼠、猪、小具有与人及多种动物（豚鼠、猪、小鼠、猴等）鼠、猴等）IgG结合的能力。结合的能力。SPA结合部位是结合部位是Fc段而不是段而不是Fab

22、段，这种结合不会影响抗体的段，这种结合不会影响抗体的活性。活性。SPA具有的结合力是双价的，每个具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面分子，也可一方面同同IgG结合，一方面与标记物如荧光素、过氧结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金、铁蛋白等相结合。化物酶、胶体金、铁蛋白等相结合。SPA对对IgG免疫球蛋白亚型的结免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如合有选择性，如SPA与人与人IgG亚型亚型IgG1、IgG2、IgG4有结合力，与有结合力，与IgG3没有结合力。没有结合力。二、二、SPA在免疫组化中的作用在免疫组化中的作用可作为二抗

23、或标记抗体。可作为二抗或标记抗体。SPA的的最大优点是不受种属特异性的限制，最大优点是不受种属特异性的限制，还具有染色时间短、灵敏性高和背景还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。染色淡等优点。SPA-胶体金技术（胶体金技术（PGA技术）技术）可在电镜水平检查抗原抗体反应的可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位，是一种较为理想的免疫电镜定位，是一种较为理想的免疫电镜技术。技术。SPA-HRP用于间接法的操作步骤：用于间接法的操作步骤：切片脱蜡切片脱蜡第一抗体，第一抗体，37，孵育，孵育30min或或4，2448hPBS冲洗，冲洗，5min3次次SPA-HRP（1:1001:400），），30

24、minDAB-H2O2显色显色复染、封片、观察、记录复染、封片、观察、记录第四节第四节凝集素凝集素凝集素（凝集素（lectin）是指一种从各种）是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，因其能的糖蛋白或结合糖的蛋白质，因其能凝集红细胞（含血型物质），故名凝凝集红细胞（含血型物质），故名凝集素。集素。植物凝集素植物凝集素刀豆蛋白刀豆蛋白A（ConA）麦胚素麦胚素（WGA）花生凝集素花生凝集素（PNA）大豆凝集素大豆凝集素（SBA）一、基本原理一、基本原理生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的

25、形式存在。凝集素的最大特点在于白和糖脂的形式存在。凝集素的最大特点在于它们能识别糖蛋白或糖脂，特别是细胞膜中复它们能识别糖蛋白或糖脂，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳水化杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳水化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作糖基专一性结合的能力。因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。麦芽素麦芽素N-乙酰糖胺乙酰糖胺菜豆凝集素菜豆凝集素N-乙酰乳糖胺乙酰乳糖胺刀豆素刀豆素-D-吡喃糖基甘露糖吡喃糖基甘露糖凝集素具有多价结

26、合的能力，能凝集素具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物质结合。蛋白等示踪物质结合。二、操作程序二、操作程序直接法：标记物直接标记在凝集直接法：标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。白或糖脂相结合。1.切片脱蜡至水；切片脱蜡至水；2.凝集素标记物（凝集素标记物（100g/ml），室温，），室温，30min；3.荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察；荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察；4.PBS洗涤，洗涤，5min3次；次；5.显色、封片、观察、记录。显色、封片、观察、记录。间

27、接法：将凝集素直接与切片间接法：将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将示踪物质标中的相应糖基结合，而将示踪物质标记在抗凝集素抗体上。记在抗凝集素抗体上。1.切片脱蜡至水；切片脱蜡至水；2.凝集素稀释液（凝集素稀释液（10g/ml），室温，），室温，30min；3.PBS洗涤，洗涤，5min3次；次；4.标记的抗凝集素抗体（标记的抗凝集素抗体（1:100），孵育），孵育30min；5.PBS洗涤，洗涤，5min3次；次；6.显色、封片、观察、记录。显色、封片、观察、记录。糖糖-凝集素凝集素-糖法：过量的凝集素糖法：过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合，再与组织切片中特定的糖基相结合，再与有

28、过氧化物酶标记的特异性糖基相与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的结合，形成一个三明治样的糖基糖基-凝集凝集素素-糖基糖基的结合物。的结合物。1.切片脱蜡至水；切片脱蜡至水；2.凝集素稀释液（凝集素稀释液（10g/ml），室温，），室温，30min；3.PBS洗涤，洗涤，5min3次；次；4.HRP标记糖基（标记糖基（10g/ml），孵育），孵育30min；5.PBS洗涤，洗涤，5min3次；次；6.显色、封片、观察、记录。显色、封片、观察、记录。三、应用三、应用作为细胞分化和成熟的标记作为细胞分化和成熟的标记淋巴细胞的分群淋巴细胞的分群小鼠胸腺皮质内不成熟的小鼠胸腺皮质内不

29、成熟的T淋巴细胞呈淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有生发中心也发现有20%左右的左右的PNA阳性反应阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的细胞，后者是否属于不成熟的T淋巴细胞，淋巴细胞，值得进一步研究。值得进一步研究。作为细胞特殊类型的标记作为细胞特殊类型的标记研究人视网膜，研究人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视锥细胞而不标记视杆细胞。标记视杆细胞。乳腺上皮细胞呈乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应，肌上皮阳性反应，肌上皮细胞呈细胞呈PNA阴性反应。阴性反应。刀豆素刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏各和蓖麻素存在于肾脏各部，部，PNA和双花扁豆

30、凝集素（和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。小球。肿瘤中凝集素结合的改变肿瘤中凝集素结合的改变肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。凝集素检测出来。凝集素可作为肿瘤特异性诊断的标凝集素可作为肿瘤特异性诊断的标记，肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化记，肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。标记。第五节第五节链霉菌抗

31、生物素蛋白检测系统链霉菌抗生物素蛋白检测系统链霉菌抗生物素蛋白是从链霉菌链霉菌抗生物素蛋白是从链霉菌中分离出来的不含糖基链的蛋白质，中分离出来的不含糖基链的蛋白质，分子量分子量47kD，含，含4个亚基，每个亚基个亚基，每个亚基都能与一个生物素分子结合。都能与一个生物素分子结合。抗生物素蛋白等电点为抗生物素蛋白等电点为10，而链，而链霉菌抗生物素蛋白等电点为霉菌抗生物素蛋白等电点为6.5，接近，接近中性，几乎不与组织中的内源性凝集中性，几乎不与组织中的内源性凝集素样物质发生非特异性结合。因此，素样物质发生非特异性结合。因此，可产生低背景、高放大的效果。可产生低背景、高放大的效果。一、一、SP法法

32、（StreptavidinPeroxidaseconjugatedmethod）生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。生物素蛋白连接的过氧化物酶结合。操作步骤：操作步骤：石蜡切片，脱蜡至水；石蜡切片，脱蜡至水；过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化酶的活性；化酶的活性；第一抗体；第一抗体；生物素标记的第二抗体；生物素标记的第二抗体；链霉菌抗生物蛋白链霉菌抗生物蛋白-过氧化物酶溶液；过氧化物酶溶液；显色、复染、封片、观察。显色、复染、封片、观察。S-P试剂盒包括以下内容：试剂盒包括以下内容：A.内源性过氧化酶阻

33、断剂内源性过氧化酶阻断剂B.正常动物非免疫血清正常动物非免疫血清C.生物素标记的第二抗体生物素标记的第二抗体D.链霉菌抗生物素蛋白链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶过氧化酶二、二、SABC法法链霉菌抗生物蛋白与一定浓度的链霉菌抗生物蛋白与一定浓度的生物素化酶混合后，就能形成链霉菌生物素化酶混合后，就能形成链霉菌抗生物素抗生物素-生物素生物素-酶复合物酶复合物(SABC)。SABC试剂盒包括以下内容：试剂盒包括以下内容：正常动物血清正常动物血清生物素化二抗生物素化二抗SABC复合物复合物SABC具有以下特点：具有以下特点：高敏感性高敏感性低背景低背景简便快速简便快速结果稳定结果稳定第六节第六节免疫金技

34、术（胶体金）免疫金技术（胶体金）1971年，年，Faulk和和Taylor首先将兔抗沙门首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。胶体金技术逐渐得到完善和成熟，应用胶体金技术逐渐得到完善和成熟，应用胶体金为标记物的免疫金染色（胶体金为标记物的免疫金染色（IGS）与免）与免疫金银染色（疫金银染色（IGSS）方法在光镜和电镜下可）方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记同时观察细胞以单标记和双标记或多种标记同时观察细胞和组织结构，可以定性、定位、定量研究。和组织结构，可以定

35、性、定位、定量研究。一、基本原理一、基本原理胶体金即金的水溶液胶体金即金的水溶液分散体系：分散相分散体系：分散相+分散介质分散介质离子分散体系：以小分子或离子状态分散离子分散体系：以小分子或离子状态分散胶体分散体系：分散相颗粒胶体分散体系：分散相颗粒1100nm粗分散体系：粗分散体系：二、胶体金的一般性状二、胶体金的一般性状1.胶体金的颜色胶体金的颜色胶体金颗粒在胶体金颗粒在520nm之间，吸收波长之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，呈葡萄酒红色2040nm之间，吸收波长之间，吸收波长530nm，呈深，呈深红色红色60nm，吸收波长，吸收波长600nm，呈兰紫色，呈兰紫色2.胶体金的稳定性

36、胶体金的稳定性溶液的稳定性介于小分子离子溶液和溶液的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的胶颗粒作布朗运动，粗分散系之间，溶胶的胶颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而溶胶又是不不易受重力影响而下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积表大，当胶粒相互碰撞时，有自动表面积表大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒的倾向。合并为较大、较重的颗粒的倾向。三、在免疫细胞化学中的应用三、在免疫细胞化学中的应用（一）免疫金染色（一）免疫金染色1.免疫金法免疫金法1978年，年，Geoghegan等首次应用免疫金等首次应用免疫金

37、探针检测探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了光镜淋巴细胞表面抗原，建立了光镜水平的免疫金法（水平的免疫金法（immunogoldstaining,IGS）间接法：间接法：（以人肝组织（以人肝组织HBsAg的定位为例）的定位为例）石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水；鼠抗鼠抗HBsAg单克隆抗体（一抗），单克隆抗体（一抗），4过夜过夜金标兔抗鼠抗体（二抗）金标兔抗鼠抗体（二抗），37，45min(可以金标可以金标SPA代替代替)复染（苏木素）、封片、观察、记录复染（苏木素）、封片、观察、记录2.蛋白蛋白A-胶体金（胶体金（PAG）放大法（以）放大法（以5-HT定位定位为例）为例）石蜡切片脱蜡至水；石

38、蜡切片脱蜡至水；兔抗兔抗5-HT抗体，抗体，4过夜，或过夜，或371hPAG371h抗抗A蛋白抗体蛋白抗体，45min，37PAG，37，45min复染、封片、观察、记录复染、封片、观察、记录PAG放大法的优点：放大法的优点：使用试剂单一；使用试剂单一；可大大提高可大大提高IGS的敏感性，从而使应用的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；成为可能；背景干净。背景干净。（二）免疫金银法（二）免疫金银法将将IGS与银显影方法相结合创立了免疫与银显影方法相结合创立了免疫金银法（金银法（immunogold-silverstaining,IG

39、SS）基本原理：基本原理：胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原）还原成银原子子(Ago)，被还原的银原子围绕金颗粒形成一，被还原的银原子围绕金颗粒形成一个个“银壳银壳”，“银壳银壳”一旦形成本身亦具有一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳银壳”越长越大，最终抗原位置得到清楚放越长越大，最终抗原位置得到清楚放大。大。以人肝细胞内以人肝细胞内HBsAg定位为例定位为例石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水；马抗马抗HBsAg抗体，抗体，4过夜或过夜或3

40、7，12hPAG，37，45min银显影银显影复染（苏木素）、封片、观察、记录复染（苏木素）、封片、观察、记录四、优点四、优点1.制备简单；制备简单；2.标记简单：抗体、标记简单：抗体、SPA、酶可通过物理吸、酶可通过物理吸附作用与胶体金颗粒形成稳定的金标复合物；附作用与胶体金颗粒形成稳定的金标复合物；3.适用范围广：光镜、透射电镜、扫描电镜、适用范围广：光镜、透射电镜、扫描电镜、X线能谱分析等。线能谱分析等。4.特异性强：免疫金探针的非特异性吸附作特异性强：免疫金探针的非特异性吸附作用小，特异性高。用小，特异性高。5.敏感性高：用于电镜，其检测抗原或抗敏感性高：用于电镜，其检测抗原或抗体的效

41、率远远超过酶反应物，大大改进了免体的效率远远超过酶反应物，大大改进了免疫组化在电镜水平上的分辩率。光镜金颗粒疫组化在电镜水平上的分辩率。光镜金颗粒经过银显影后得到放大，敏感性比经过银显影后得到放大，敏感性比PAP法高法高200倍，比倍，比ABC法高法高6倍，是迄今为止最为敏倍，是迄今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适用于检测微感的免疫细胞化学方法，特别适用于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。双标记及多重标记：胶体金制备双标记及多重标记：胶体金制备成不同大小的颗粒，分别标记不同的成不同大小的颗粒，分别标记不同的抗原或抗体。抗原或抗体。第七节第七节半抗原

42、交联抗体法半抗原交联抗体法近年来，为提高敏感性和减低非特近年来，为提高敏感性和减低非特异性染色，在常规免疫组化技术的基础异性染色，在常规免疫组化技术的基础上，发展了半抗原交联抗体法（上，发展了半抗原交联抗体法（hapten-coupledtechnique），可作免疫酶或免），可作免疫酶或免疫荧光染色。疫荧光染色。基本原理：基本原理：半抗原标记第一抗体半抗原标记第一抗体半抗原：阿散酸（对氨基苯砷酸）半抗原：阿散酸（对氨基苯砷酸）、对氨基苯酰甘氨酸、亚对氨苯酰甘、对氨基苯酰甘氨酸、亚对氨苯酰甘氨酸、二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂氨酸、二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂（DNP），通过酰胺化反应把半抗原），通过酰

43、胺化反应把半抗原结合到抗体分子上。结合到抗体分子上。操作程序：操作程序：间接法（二步法）：间接法（二步法）：石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水；半抗原标记的特异性抗体（一抗）；半抗原标记的特异性抗体（一抗）；荧光素或酶标记的抗半抗原抗体荧光素或酶标记的抗半抗原抗体；荧光显微镜观察，或加底物显色。荧光显微镜观察，或加底物显色。优点：优点：1.敏感性高：由于本法是通过酰胺化反敏感性高：由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原，对抗体活性损失极小，抗体应标记半抗原，对抗体活性损失极小，抗体保留较高的活性，能结合大量半抗原，平均保留较高的活性，能结合大量半抗原，平均每个球蛋白分子可同时结合每个球蛋白分子可同

44、时结合20个半抗原分子，个半抗原分子，每个半抗原又可与抗半抗原抗体相结合，特每个半抗原又可与抗半抗原抗体相结合，特异性免疫反应明显放大，其敏感性明显高于异性免疫反应明显放大，其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术，特别有常规的免疫酶和免疫荧光染色技术，特别有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织。少的组织。2.可用于双重免疫染色：利用两种无交叉可用于双重免疫染色：利用两种无交叉反应的半抗原（如阿散酸、对氨基苯酰甘氨反应的半抗原（如阿散酸、对氨基苯酰甘氨酸）分别标记来自同一种动物的两种特异性酸）分别标记来自同一种动物的两种特异性第一抗体，即可

45、在同一张切片内同时显示两第一抗体，即可在同一张切片内同时显示两种不同的抗原。种不同的抗原。3.特异性强，敏感性高，背景染色低。特异性强，敏感性高，背景染色低。第八节第八节多聚螯合物酶法多聚螯合物酶法多聚螯合物酶二步法，也称非多聚螯合物酶二步法，也称非生物素检测系统，与简单的二步法生物素检测系统，与简单的二步法相比，具有敏感性和特异性高、稳相比，具有敏感性和特异性高、稳定性好的优点。定性好的优点。一、一、EnVisionSystem(DAKO)EnVisionSystem是将二抗和酶通过一个多聚化合物是将二抗和酶通过一个多聚化合物（葡聚糖）骨架联接成一个多聚体（即（葡聚糖）骨架联接成一个多聚体（

46、即EnVision），每一），每一个分子的复合物中约含个分子的复合物中约含70个分子的个分子的POD和和10个分子的第二抗个分子的第二抗体，复合物中的体，复合物中的POD的绝对数量远高于其他复合物，直接放的绝对数量远高于其他复合物，直接放大信号大信号4050倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。同时，人体内不存在该多聚化合物，无特异性干扰，孵育。同时，人体内不存在该多聚化合物，无特异性干扰，故背景染色浅。故背景染色浅。EnVisionSystem工作程序：工作程序：1.脱蜡、水化组织切片；脱蜡、水化组织切片；2.一抗孵育一抗孵育1030min;3.P

47、BS漂洗漂洗;4.EnVisionTM孵育孵育1030min;5.PBS漂洗漂洗6.显色、复染、封片。显色、复染、封片。特点：特点：敏感敏感省时省时方便方便背景低背景低（避免了内源性生物素干扰）（避免了内源性生物素干扰）二二.PowerVisionTM二步法二步法:是美国是美国PowerVision公司推出的公司推出的产品，其检测效率高于产品，其检测效率高于EnVision法。法。三三.EPOS法法 EPOS法（法（enhanced ploymer one-stop staining）是）是DAKO公司近年来公司近年来推出的一步染色法。原理是采用一种惰性的多推出的一步染色法。原理是采用一种惰性

48、的多聚化合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体聚化合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体（一抗）和（一抗）和POD结合在一起，形成结合在一起，形成POD-多多聚化合物聚化合物-特异性抗体巨大复合物。复合物内特异性抗体巨大复合物。复合物内不含第二抗体及亲和素。不含第二抗体及亲和素。EPOS法操作程序：法操作程序：1.石蜡切片常规脱蜡至水石蜡切片常规脱蜡至水;2.Dako EPOS/POD试剂，孵育试剂，孵育3060min;3.PBS漂洗漂洗 3min 3次次;4.显色、复染、封片。显色、复染、封片。四四.UIP法法 UIP（universal immuno-enzyme polymer）法，其原理是以氨

49、基酸类为骨架，）法，其原理是以氨基酸类为骨架，形成形成POD-氨基酸氨基酸-二抗复合物（二抗复合物（N-Histofine复合物）。由于多聚物中有复合物）。由于多聚物中有N末端暴露，形成的末端暴露，形成的电荷能与组织发生静电吸附，可造成非特异性染电荷能与组织发生静电吸附，可造成非特异性染色，染色时需平衡静电荷。色，染色时需平衡静电荷。第九节第九节组织芯片技术组织芯片技术 组织芯片又称组织微阵列，是生物芯片的一组织芯片又称组织微阵列，是生物芯片的一种，将数十种、上百种甚至上千种的不同组织点种，将数十种、上百种甚至上千种的不同组织点在一张固体载体（通常是载玻片）。可以按照不在一张固体载体（通常是载

50、玻片）。可以按照不同的需求设计组织排列，具有高通量、可比性强、同的需求设计组织排列，具有高通量、可比性强、节约大量成本的优点，减少了实验误差，尤其适节约大量成本的优点，减少了实验误差，尤其适用于大样本的研究。对研究疾病不同病理发展阶用于大样本的研究。对研究疾病不同病理发展阶段各基因表达的动态变化、相关基因验证、治疗段各基因表达的动态变化、相关基因验证、治疗靶点的定位、抗体和药物的筛选等均有重大的使靶点的定位、抗体和药物的筛选等均有重大的使用价值。用价值。组织芯片的制备：组织芯片的制备：1.芯片的设计；芯片的设计；2.根据设计将载体蜡块打孔；根据设计将载体蜡块打孔；3.观察组织切片，在供体蜡块上