酶的定向进化 (2)精选文档.ppt

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1、酶的定向进化2023/1/29本讲稿第一页，共十二页酶分子的定向进化概念：模仿自然进化过程的人工进化策略。不需要事先了解蛋白质的结构和作用机制，去获得期望功能或全新功能的蛋白质或DNA。如从一个靶基因或一群相关家族基因或DNA开始，用突变或重组等手段去创建分子的多样性，然后对这多样性文库进行筛选，获得具有新功能的基因或DNA。此方法正在发展中。2023/1/29本讲稿第二页，共十二页酶分子改造技术的分类一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰，定点突变等；二是利用基因的可操作性，通过模拟自然界的演化进程进行非合理化设计方案。酶分子的定向进化属于蛋白质的非合理设计方式。2023/1/29本讲稿第

2、三页，共十二页1993年年,美国科学家美国科学家Arnold F H首先提出酶首先提出酶分子的定向进化的概念分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶造或构建新的非天然酶.酶分子定向进化的历史1994年Stemmer等人首次利用基因从组技术获得了理想的突变体，开拓了酶分子定向进化的方法。2023/1/29本讲稿第四页，共十二页2006年,Ryota等为基因片段重组这一思想增添了新的内容,开发出一新的突变文库构建方法随机片段交换法(RAndomInsertional-deletionalStrandExchangemutagenesis,RAISE)。该方法主要由

3、三个步骤组成,即基因破碎;添加随机短序列;重新组装。2023/1/29本讲稿第五页，共十二页酶定向进化的基本过程主要包括：随机突变、构建突变基因文库、定向选择。基本过程的图示：酶基因酶基因随机突变随机突变构建突变基因文库构建突变基因文库筛选筛选正突变基因正突变基因反复进行反复进行进化酶进化酶负突变基因负突变基因2023/1/29本讲稿第六页，共十二页目前酶定向进化的主要策略1.易错PCR 技术 是指利用TaqDNA聚合酶不具有3-5 外切酶活力，或改变正常PCR的反应条件的技术 在进行PCR 扩增目的基因时，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，导致目的基因发生随机突变。是一种非重组型构建

4、突变文库的方法。2023/1/29本讲稿第七页，共十二页2.DNA重组技术(又称有性PCR)是基因在分子水平上进行有性重组(sexualcombination)。该方法由stemmer于1994年引入到蛋白质的定向进化过程中,并成功地改造了数十种具有工业用途的蛋白质。该方法通过改变单个基因或基因家族(genefamily)原有的核苷酸序列,创造新基因,并赋予表达产物以新功能。2023/1/29本讲稿第八页，共十二页单一基因单一基因DNA重组原理图示2023/1/29本讲稿第九页，共十二页3.外显子改组技术外显子改组(exonshuffling)类似于DNA改组,两者都是在各自含突变的片段间进行交换,与DNA改组不同,外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动,而DNA改组不受任何限制,发生在整个基因片段上。外显子改组更适用于真核生物,并可获得各种大小的随机肽库。2023/1/29本讲稿第十页，共十二页4.基因家族重排技术2023/1/29本讲稿第十一页，共十二页2023/1/29本讲稿第十二页，共十二页