第6节 载体系统(精品).ppt

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1、第六节 载体系统1 1 质粒载体质粒载体2 2 噬菌体载体噬菌体载体3 3 cosmid克隆载体克隆载体4 4 噬菌粒载体噬菌粒载体5 5 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体6 6 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体1 质粒载体质粒载体1.1 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1.2 基因工程中的质粒载体基因工程中的质粒载体1.3 pBR322质粒载体质粒载体1.4 pUC质粒载体质粒载体1.5 穿梭质粒载体穿梭质粒载体1.6 质粒载体的稳定性问题质粒载体的稳定性问题1.1 质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特性1.1.1 1.1.1 质粒的概念质粒的概念 质粒（质粒（plasmi

2、dplasmid）是独立于染色体外、具）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在小的核酸分子，大小范围在1kb-200kb1kb-200kb以上以上不等。不等。1.1.2 1.1.2 细菌质粒的一般生物学特性细菌质粒的一般生物学特性(1)(1)很多细菌中已发现；很多细菌中已发现；(2)(2)是独立于细菌染色体之外的辅助性遗是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大部分为双链环状传单位，基因组绝大部分为双链环状DNADNA，不同质粒大小各异；，不同质粒大小各异；(3)(3)大多数质粒的宿主范围较窄；大多数质粒的宿

3、主范围较窄；(4)(4)已发展进化出多种机制以维持其在已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不细菌宿主中的稳定的拷贝数；在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。同的宿主细胞中拷贝数可能不同。(5)(5)复制转录的进行依赖于宿主编码的复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质；酶和蛋白质；(6)(6)常含有一些编码对细菌宿主有利的常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。酶的基因。单链切割单链切割连接连接单链切割单链切割连接连接共价闭合环形共价闭合环形DNA（scDNA型）型）开环开环DNA（ocDNA）线性线性DNA（cccDNA）环形双链的质粒环形双链的质粒DNADNA分子具有三种

4、不同构型分子具有三种不同构型1.1.3 质粒的命名质粒的命名 用小写字母用小写字母p代表质粒代表质粒（plasmid），在），在p字字母后用母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称者或实验室名称，再加上，再加上质粒编号质粒编号。如：如：pBR322：p表示一种质粒，而表示一种质粒，而“BR”则则是分别取自该质粒的两位主要构建者是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和和R.L.Rodriguez，322为编号。为编号。1.1.4 质粒给宿主细胞的标记质粒给宿主细胞的标记 (1)(1)氨苄青霉素氨苄青霉素 (AmpicillinAmpicil

5、lin)(2)(2)卡那霉素卡那霉素 (KanamycinKanamycin)(3)(3)四环素（四环素（TetracyclineTetracycline）(4)(4)氯霉素氯霉素(C Chloramphenicolhloramphenicol)(5)(5)链霉素（链霉素（StreptomycinStreptomycin）(6(6）潮霉素（）潮霉素（HygromycinHygromycin ）1.1.5 质粒的复制类型质粒的复制类型据质粒据质粒DNADNA复制与宿主之间的关系分为：复制与宿主之间的关系分为：（1 1）“严紧型严紧型”复制控制的质粒复制控制的质粒(stringent(string

6、ent plamidplamid)：拷贝数少：拷贝数少 ；（2 2）“松弛型松弛型”复制控制的质粒复制控制的质粒(relaxed(relaxed plasmid)plasmid)：拷贝数多。：拷贝数多。1.1.6 1.1.6 质粒质粒DNADNA的转移的转移(1)质粒的类型质粒的类型 据能否自我转移可分为据能否自我转移可分为:接合型接合型（conjugative plasmid)非接合型非接合型（non-conjugative plasmid)(2)F质粒质粒(fertility factor)F+又叫雄性决定因子，所以又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，相应细胞又叫雄性细胞，相应的的

7、 F 又叫雌性细胞。又叫雌性细胞。F质粒质粒(约约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式：在寄主细胞中有三种不同存在方式：F+F Hfr。1.1.7 质粒的转化质粒的转化 转化（转化（transformation）：是将异源是将异源DNADNA分子引入另一细胞品系，分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。质粒转化质粒转化细菌细菌常用常用方法：方法：热激法、电击法热激法、电击法 1.2 基因工程中的质粒载体基因工程中的质粒载体1.2.1 两个概念两个概念克隆载体克隆载体(cloning vector):使目的片段能在细菌细胞中复制的载体使目

8、的片段能在细菌细胞中复制的载体;表达载体（表达载体（Expression Vector）:使目的基因能在细菌细胞中表达为使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白或蛋白质的载体。质的载体。1.2.2 克隆载体必备条件克隆载体必备条件（1 1）具有复制起点）具有复制起点（2 2）具有抗菌素抗性基因）具有抗菌素抗性基因（3 3）具有若干限制酶单一识别位点）具有若干限制酶单一识别位点（4 4）具有较小的相对分子质量和较高的）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。拷贝数。1.2.3 表达载体的必备条件(1)(1)能自主复制能自主复制(2)(2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记具有方便、灵活的克隆位点

9、和筛择标记(3)(3)具有能为具有能为 RNARNA聚合酶识别的强大启动子聚合酶识别的强大启动子(4)(4)启动子应可受诱导调控启动子应可受诱导调控(5)(5)具有强终止子具有强终止子(6)(6)具有翻译起始信号具有翻译起始信号 1.2.4 天然质粒用作载体的局限性天然质粒用作载体的局限性天然质天然质 粒粒相对分子质量相对分子质量拷贝数拷贝数单一酶切位点单一酶切位点选择性标记选择性标记复制类型复制类型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr严紧严紧ColE14.210620EcoR I大肠杆菌素大肠杆菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I(BamH I)a

10、mpr松弛松弛局限性：局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、位点少、选择标记不合适选择标记不合适 1.2.5 质粒载体的选择标记质粒载体的选择标记常用的选择标记：常用的选择标记：抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。素等基因。选择标记的应用：选择标记的应用：利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。1.3 pBR322质粒载体质粒载体pBR322质粒载体的形体图质粒载体的形体图pBR322质粒载体的结构来源质粒载体的结构来源TetrAmprOripBR

11、322质粒载体的优点：质粒载体的优点：具有较小的相对分子质量具有较小的相对分子质量(4363bp)具有两种抗菌素抗性基因可供作转具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号化子的选择记号(Ampr和和Tetr)具有较高的拷贝数（具有较高的拷贝数（15个个,松弛型）松弛型）DNA连接酶连接酶pBR322质粒载体质粒载体tetr基因插入失活效应基因插入失活效应1.4 pUC质粒载体质粒载体pUC18pUC19含四个部分：含四个部分：（1）来自）来自pBR322的质粒的质粒复制起点（复制起点（ori）；）；（2）ampr;（3）大肠杆菌大肠杆菌半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（基因（lacZ）的启动子及其）

12、的启动子及其编码编码-肽链的肽链的DNA序列；序列；（4）多克隆位点）多克隆位点（MCS）lacZOriAmprMCS Blue WhiteampramprInsertInsertNo insertLac ZLac Z具更小的分子质量具更小的分子质量(2.69kb)(2.69kb)和更和更 高的拷贝数高的拷贝数(500-700(500-700个个)适于组织化学方法检测重组体适于组织化学方法检测重组体具多克隆位点具多克隆位点MCSMCS区段区段pUCpUC质粒载体的优点质粒载体的优点1.5 穿梭质粒载体穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）是一类由人工构建的具有两种不同复制

13、起是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。胞中存活和复制的质粒载体。大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母酿酒酵母穿梭质粒载体穿梭质粒载体其它重要的质粒载体其它重要的质粒载体改造过的质粒载体非常多改造过的质粒载体非常多能能在在体体外外转转录录克克隆隆基基因因的的质质粒粒载载体体1.6 质粒载体的稳定性问题质粒载体的稳定性问题（1 1）不稳定性类型）不稳定性类型 分离不稳定性分离不稳定性 结构不稳定性结构不稳定性（2 2）影响稳定性主要因素）影响稳定性主要因素 新陈代谢负荷新陈代谢负荷 拷贝数差度拷贝数差度2

14、噬菌体载体噬菌体载体2.1 2.1 噬菌体的结构及其核酸类型噬菌体的结构及其核酸类型2.2 2.2 噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期2.3 2.3 噬菌体载体噬菌体载体2.4 M132.4 M13噬菌体载体噬菌体载体2.1 2.1 噬菌体的结构及其核酸类型噬菌体的结构及其核酸类型 不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。三种不同基本类型：三种不同基本类型：无尾部的二十面体型无尾部的二十面体型具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）线状体型线状体型T2噬菌体结构示意图噬菌体结构示意图 双链线性双链线性DNA（最常见）

15、（最常见）双链环形双链环形DNA 单链环形单链环形DNA 单链线性单链线性DNA 单链单链RNA噬菌体的核酸：噬菌体的核酸：2.2 2.2 噬菌体的生命周期噬菌体的生命周期（1 1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2 2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）（1）烈性噬菌体的生活周期）烈性噬菌体的生活周期t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内秒钟内就会发生噬菌体就会发生噬菌体DNA的注入；的注入；t=1 寄主寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭；和蛋白质的合成反应被

16、全部关闭；t=2 第一个噬菌体第一个噬菌体mRNA开始合成；开始合成；t=3 细菌细菌DNA开始降解；开始降解；t=5 噬菌体噬菌体DNA合成开始启动；合成开始启动；t=9 “晚期晚期”噬菌体噬菌体mRNA开始合成；开始合成；t=12 出现完整的头部和尾部结构；出现完整的头部和尾部结构；t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒；出现头一个完整的噬菌体颗粒；t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒个左右的噬菌体时粒E.coliE.coli T4 T4噬菌体的生命周期（以分钟记）噬菌体的生命周期（以分钟记）裂解循环裂解循环溶源态溶源态（2）温和噬菌体）温和

17、噬菌体的生活周期的生活周期cI OR PR PL OL基因基因早期左向转录早期左向转录早期右向转录早期右向转录基因基因噬菌体的阻遏噬菌体的阻遏-操纵基因系统操纵基因系统CI=阻遏基因；阻遏基因；P=启动子；启动子；O=操纵基因；操纵基因；L=左向；左向；R=右向右向注：注：cI基因和基因和cro基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（基因编码的蛋白质，同两个操纵基因（OL，OR）之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个）之间的相互作用决定是发生溶菌反应还是溶源反应，如这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。操纵基因都已摆脱了阻遏状态，则进入溶菌周期。2.3 2.3 噬菌体载体

18、噬菌体载体2.3.1 2.3.1 噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述2.3.2 2.3.2 噬菌体载体噬菌体载体2.3.1 2.3.1 噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述 噬菌体颗粒中的噬菌体颗粒中的DNADNA是一线性双链是一线性双链DNADNA分分子，长子，长48 502bp48 502bp，两端各有，两端各有1212个碱基的个碱基的55凸凸出黏性末端是互补的。进入细胞的出黏性末端是互补的。进入细胞的DNADNA通通过两端的黏性末端环化。过两端的黏性末端环化。噬菌体上有些基因可被取代而不影响其噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。生活周期。噬菌体噬菌体DNADNA

19、的核酸内切限制酶的限制图（的核酸内切限制酶的限制图（KbKb）2.3.2 噬菌体载体噬菌体载体 主要有如下特点：主要有如下特点：(1)(1)筛选简便；筛选简便；(2)(2)可克隆的片段大，最大可达可克隆的片段大，最大可达23 kb23 kb，而质粒最大仅而质粒最大仅10 kb10 kb左右；左右；(3)(3)转化效率高。转化效率高。噬菌体载体可分为：噬菌体载体可分为：插入型载体插入型载体 替换型载体替换型载体注意：注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNADNA大小只能：大小只能：38kb 52kb。体外包装：体外包装：噬菌载体噬菌载体 +尾部蛋白尾部蛋白 +头部

20、蛋白头部蛋白 噬菌体载体是主要用于噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。也经常用于外源目的基因的克隆。4 M13噬菌体载体噬菌体载体 6.4 kb6.4 kb单链环状正链单链环状正链DNADNA基因组。基因组。作载体的优点：作载体的优点：(1)(1)单链单链DNA噬菌的复制噬菌的复制,是以双链环形是以双链环形DNA为中间媒为中间媒介介,这种复制形式的这种复制形式的DNA,可以同质粒可以同质粒DNA一样一样,在在体外进行纯化和操作体外进行纯化和操作；(2)(2)RF DNA 和和SS DNA都可感染都可感染E.coli，产生噬菌斑；，产生噬菌斑；(3)(3

21、)无包装限制问题（可无包装限制问题（可6 6倍于倍于M13M13基因组）；基因组）；(4(4）易测出外源易测出外源DNADNA的插入方向；的插入方向；(5(5）可产生能直接测序的单链可产生能直接测序的单链DNADNA分子。分子。5 5 cosmid克隆载体克隆载体 cosmid（cos site-carring plasmid）人工构建的含有人工构建的含有DNA的的cos（cohesive-end site)位点序列和位点序列和质质粒复制子粒复制子的特殊类型的质粒载体。的特殊类型的质粒载体。pHC796.4 kb柯斯质粒载体柯斯质粒载体pHC79的形体图的形体图由由pBR322质粒质粒DNA与

22、与噬菌体噬菌体DNA的的cos位点及其控制位点及其控制包装作用的序列构成包装作用的序列构成部分柯斯质粒的基本特性部分柯斯质粒的基本特性柯斯质粒载体的特点：柯斯质粒载体的特点：（1）具有）具有噬菌体的特性噬菌体的特性（但因不含（但因不含噬菌体噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）；无法形成子代噬菌体颗粒）；（2）具有质粒的特性）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌（有质粒复制子及抗菌素基因）；素基因）；（3）具有高容量的克隆能力）具有高容量的克隆能力（本身仅（本身仅5-7kb,克隆极限可达克隆极限可达45kb左右）；左右）；（4）

23、具有与同源序列质粒进行重组的能力。）具有与同源序列质粒进行重组的能力。广泛应用于基因组广泛应用于基因组DNA文库的构建。文库的构建。柯斯克隆柯斯克隆（cosmid cloning）理论依据是：理论依据是：1 1）在线性噬菌体）在线性噬菌体DNADNA分子的每一端，都具有一段彼此互补分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列的单链突出序列（coscos位点位点)。2 2）在）在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNADNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个前后两个DNADNA基因组之间都是通过基因组之

24、间都是通过coscos位点连接起来的。位点连接起来的。3 3）噬菌体具有的一种位点特异的切割体系噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-(site-specific cutting system),specific cutting system),又叫又叫TerTer体系，体系，能识别两个相能识别两个相距适宜的距适宜的coscos位点位点(38-45kb)(38-45kb)，将多连体分子切割成将多连体分子切割成单位单位长度的片段，并将它们包装到长度的片段，并将它们包装到噬菌体头部中去。噬菌体头部中去。(如如EcoR I)38kb52kb应用柯斯质粒作载体构建基因组文库的一般程序应用柯斯质

25、粒作载体构建基因组文库的一般程序四四 噬菌粒载体噬菌粒载体（phagemid vector)由质粒载体和单链噬菌体载体结由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（粒（phagemid或或phasmid）噬菌粒噬菌粒质粒质粒单链噬单链噬菌体菌体辅助噬菌体辅助噬菌体 大肠杆菌大肠杆菌寄主菌株寄主菌株pEMBL8pUC8f1IR171/18pRSA101VXM13M13变异株变异株 XS127，XS101pUC118/pUC119pUC18/pUC19M13M13K07MV1184pBSpUCf1M13K07XL-Blue几种常用的噬菌粒载体的一般特

26、征几种常用的噬菌粒载体的一般特征pUC119(MCS)pUC118(MCS)puC118和和pUC119噬噬菌粒载体菌粒载体的分子结的分子结构构（1）无辅助噬菌体时）无辅助噬菌体时pUC118/pUC119的复制的复制亲本亲本pUC质粒质粒（2）有辅助噬菌体时）有辅助噬菌体时pUC118/pUC119的复制的复制M13辅助噬菌体的基因组辅助噬菌体的基因组pUC118/pUC119噬菌粒载体的两种复制模型噬菌粒载体的两种复制模型噬菌粒载体的优点噬菌粒载体的优点（1 1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNADNA，可克隆高达，可克隆高达10 kb1

27、0 kb的外源的外源DNADNA；（2 2）有有ampampr r 等基因作为选择记号；等基因作为选择记号；（3 3）拷贝数高；拷贝数高；（4 4）存在多克隆位点存在多克隆位点,可克隆达可克隆达10 kb10 kb的外源的外源DNADNA；（5 5）可用组织化学显色反应筛选重组子；可用组织化学显色反应筛选重组子；（6 6）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制；克隆外源基因可按质粒一样复制；（7 7）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链染的宿主细胞中，可合成出单

28、链DNADNA拷贝，并包拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。(8)(8)可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。(yeast artificial chromosome,YAC)真核生物染色体的几个最为重要的部位：真核生物染色体的几个最为重要的部位：端粒重复序列端粒重复序列（telomeric repeat，TEL）着丝粒着丝粒（centromere，CEN）自主复制序列自主复制序列（autonomously replication sequences，ARS）YAC 载体的载体的选择标记选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮

29、氨主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因酸合成缺陷型基因 trp 1、leu 2 YAC本身可小至本身可小至8 kb（如（如pYAC2质粒），克隆能力可达质粒），克隆能力可达1000 kb以上。以上。五五 酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(bacterial artificial chromosome,BAC)BAC载体是建立在大肠杆菌的载体是建立在大肠杆菌的F因子（大小约因子（大小约100kb）的基因础上；的基因础上；人工构建的人工构建的BAC较小（如较小（如pBeloBAC11仅有仅有7.4 kb，保保留了与留了与F因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因相关基因），但其克隆能力可达），但其克隆能力可达300 kb以上，远大于柯斯以上，远大于柯斯质粒，但小于质粒，但小于YAC。六六 细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体