多酚氧化酶活性的测定.ppt

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1、实验实验 多酚氧化酶活性的测定多酚氧化酶活性的测定一、实验目的：一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解诸如：果掌握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。实受伤、组织变褐的原因等。二、原理与方法二、原理与方法 多酚氧化酶（多酚氧化酶（PPOPPO）催化各种酚与）催化各种酚与O2O2氧化为醌。本实验氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在是采用邻苯二酚为底物，在0.2M0.2M磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.1M0.1M柠檬酸缓柠檬酸缓冲液冲液PH6.0PH6.0的反应体系中，的反应体系中，PPOPPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分

2、光光度计在分光光度计410nm410nm处使反应体系的处使反应体系的ODOD值产生变化，通过值产生变化，通过ODOD值上升的读数变化确定值上升的读数变化确定PPOPPO的酶活大小。的酶活大小。三、仪器与试剂0.5%邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0、试管、恒温水浴、分光光度计等四、实验方法：四、实验方法：1.1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。定。2.2.酶液的制备：称取样品酶液的制备：称取样品5.0g5.0g，用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至至100ml100ml，在

3、，在18-2018-20下浸提下浸提3030分钟，中间摇动数次，过滤备分钟，中间摇动数次，过滤备用。用。3.3.测定：测定：（1 1）对照：在含有）对照：在含有6mlpH6.06mlpH6.0的的0.2M0.2M磷酸氢二钠磷酸氢二钠0.1M0.1M柠檬酸柠檬酸缓冲液试管中加入缓冲液试管中加入1ml0.5%1ml0.5%邻苯二酚溶液，在邻苯二酚溶液，在3030恒温水浴恒温水浴中预热后加入中预热后加入1ml1ml灭酶后的酶液，灭酶后的酶液，2ml2ml蒸馏水，以此调零。蒸馏水，以此调零。（2 2）样品测定：在含有）样品测定：在含有6mlpH6.06mlpH6.0的的0.2M0.2M磷酸氢二钠磷酸氢

4、二钠0.1M0.1M柠柠檬酸缓冲液试管中加入檬酸缓冲液试管中加入1ml0.5%1ml0.5%邻苯二酚溶液，在邻苯二酚溶液，在3030恒温恒温水浴中预热后加入水浴中预热后加入1ml1ml酶液，反应酶液，反应5 5分钟，加热灭酶以终止反分钟，加热灭酶以终止反应，以应，以5000r/min5000r/min离心离心1010分钟，取上清液备用。在分钟，取上清液备用。在410nm410nm下测下测定吸光度。定吸光度。五、实验结果记录：五、实验结果记录：以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位（u）式中：A410：反应时间内吸光度的变化，W：样品鲜重g，t：反应时间min，VT：提取酶液总体积ml，Vs：测定时取用酶液体积ml。