浙江大学分析化学 08-工分析-7.ppt

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1、第八章 紫外可见分光光度法Ultraviolet and Visible Spectrophotometry学习要求1了解物质颜色与光的吸收关系了解物质颜色与光的吸收关系2了了解解紫紫外外可可见见分分光光光光度度法法的的仪仪器器及及测测量量误误差和测量条件的选择差和测量条件的选择3了解显色反应及其影响因素了解显色反应及其影响因素4熟悉紫外熟悉紫外可见分光光度法的实际应用可见分光光度法的实际应用5掌握朗伯掌握朗伯比尔定律及其偏离的原因比尔定律及其偏离的原因6掌握紫外掌握紫外可见分光光度法的测定方法可见分光光度法的测定方法1/28/20231/28/20232 2分光光度法分光光度法9.1 概述9

2、.2 光的吸收定律朗伯比尔定律9.3 紫外可见分光光度计及测定方法9.4 显色反应及其影响因素9.5 紫外可见分光光度法的误差和测量 条件的选择9.6 紫外可见分光光度法应用实例1/28/20231/28/20233 3分光光度法分光光度法9.1 概述分光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。特点：*灵敏度较高（110gL-1），适用于微量组分的测定。但相对误差较大（25%）。*具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。1/28/20231/28/20234 4分

3、光光度法分光光度法9.1.1光的基本性质 光是一种电磁波。所有电磁波都具有波粒二象性。光的波长、频率与光速c的关系为：光速在真空中等于2.9979108ms-1。光子的能量与波长的关系为：式中E为光子的能量；为频率；h为普朗克常数，为6.62610-34JS。1/28/20231/28/20235 5分光光度法分光光度法电磁波谱电磁波谱1/28/20231/28/20236 6分光光度法分光光度法表9-1 电磁波谱范围表光谱名称波长范围 跃迁类型 分析方法X射线 10-1100nm K和L层电子 X射线光谱法远紫外光 10200nm 中层电子 真空紫外光度法近紫外光 200400nm 外层电子

4、 紫外光度法可见光 400750nm 外层电子 比色及可见光度法近红外光 0.752.5m 分子振动 近红外光谱法中红外光 2.55.0m 分子振动 中红外光谱法远红外光 5.01000m 分子转动和振动 远红外光谱法微波 0.1100cm 分子转动 微波光谱法无线电波 11000m 核的自旋 核磁共振光谱法1/28/20231/28/20237 7分光光度法分光光度法9.1.2物质的颜色与光的关系P单色光(monochromatic light)只具有一种波长的光。P混合光 由两种以上波长组成的光。P白光白光是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。P物质的颜色是由于物质

5、对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。例如：硫酸铜溶液因吸收白光中的黄色光而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。因此，物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。1/28/20231/28/20238 8分光光度法分光光度法光的互补性与物质的颜色如果把两种适当颜色的光如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混合也可按一定的强度比例混合也可以得白光，这两种光就叫以得白光，这两种光就叫互互补色光补色光。如果吸收光在可见区如果吸收光在可见区,吸吸收光的颜色与透过光的颜色收光的颜色与透过光的颜色为互补关系为互补关系,物质呈现物质呈现透过透过光光的颜色。的颜色。如果吸收光在紫外区，如果吸

6、收光在紫外区，则物质则物质不呈现不呈现颜色颜色1/28/20231/28/20239 9分光光度法分光光度法P如果把两种适当颜色的如果把两种适当颜色的光按一定的强度比例混光按一定的强度比例混合也可以得到白光，这合也可以得到白光，这两种光就叫互补色光。两种光就叫互补色光。图中处于一条直线的两图中处于一条直线的两种色光都是互补色光。种色光都是互补色光。1/28/20231/28/20231010分光光度法分光光度法吸收光谱吸收光谱(absorption spectrum)或吸或吸收曲线收曲线测定某种物质对不同波长测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度

7、为纵坐标为横坐标，吸光度为纵坐标作图。作图。KMnOKMnO4 4溶液对波长溶液对波长525nm525nm附近的绿色光吸收最附近的绿色光吸收最强，而对紫色光吸收最弱。强，而对紫色光吸收最弱。光吸收程度最大处的叫做光吸收程度最大处的叫做最最大吸收波长大吸收波长，用，用 maxmax表示。表示。不同浓度的不同浓度的KMnOKMnO4 4溶液所得溶液所得的吸收曲线都相似，其最大的吸收曲线都相似，其最大吸收波长不变，只是相应吸收波长不变，只是相应1/28/20231/28/20231111分光光度法分光光度法E=hE=hv=h(Cv=h(C/)分子的吸收分子的吸收分子的吸收分子的吸收光谱是与其光谱是与

8、其光谱是与其光谱是与其相应的电子相应的电子相应的电子相应的电子能级特征相能级特征相能级特征相能级特征相关的。同时关的。同时关的。同时关的。同时也与振动和也与振动和也与振动和也与振动和转动能级有转动能级有转动能级有转动能级有关。关。关。关。分子的光吸收机理分子的光吸收机理 1/28/20231/28/20231212分光光度法分光光度法9.2 光的吸收定律Lambert-beer定律9.2.1 朗伯比尔定律当一束平行的单色光照射到有色溶液时，光的一部分将被溶液吸收，一部分透过溶液，还有一部分被器皿表面所反射。设入射光强度为I0，透过光强度为It，溶液的浓度为c，液层宽度为b，经实验表明它们之间有

9、下列关系：1/28/20231/28/20231313分光光度法分光光度法透光度、吸光度与溶液浓度及液层宽透光度、吸光度与溶液浓度及液层宽度的关系度的关系溶液浓度与宽度的乘积与吸光度成正比，而不是与透溶液浓度与宽度的乘积与吸光度成正比，而不是与透光度成正比。光度成正比。上式中比例系数上式中比例系数K K与入射光波长、溶液的性质及温度有与入射光波长、溶液的性质及温度有关。当关。当 和和T T一定时，一定时，K K代表单位浓度的有色溶液放在代表单位浓度的有色溶液放在单位宽度的比色皿中的吸光度。单位宽度的比色皿中的吸光度。浓度单位不同浓度单位不同K K的单位也不同的单位也不同:当当c c的单位为的单

10、位为gLgL-1-1，b b的的单位为单位为cmcm时，时，k k以以a a表示，称为吸光系数表示，称为吸光系数(absorption(absorption coefficient)coefficient)，其单位为，其单位为LgLg-1-1cmcm-1-1，此时上式变为，此时上式变为:1/28/20231/28/20231414分光光度法分光光度法如如果果浓浓度度c c的的单单位位为为molLmolL-1-1，b b的的单单位位为为cmcm，这这时时k k常常用用 表表示示,称称摩摩尔尔吸吸光光系系数数(molar(molar absorptivityabsorptivity)，单单位位为为

11、LmolLmol-1-1cmcm-1-1，它它表表示示吸吸光光质质点点的的浓浓度度为为1molL1molL-1-1，溶溶液液的的宽宽度度为为1cm1cm时时，溶溶液液对对光光的的吸吸收收能能力力。值值越越大大，表表示示吸吸光光质质点点对对某某波波长长的的光光吸吸收收能能力力愈愈强强，故故光光度度测测定定的的灵灵敏敏度度越越高高。值值在在10103 3以以上上即即可可进进行行分分光光光光度度法法测测定定，高高灵灵敏敏度度的的分分光光光光度度法法可可达达到到10105 510106 6。式。式(9-3)(9-3)可写成为：可写成为：A=A=bcbc 与与a a的关系为：的关系为：=M a=M a式

12、中式中MM为吸光物质的摩尔质量为吸光物质的摩尔质量1/28/20231/28/20231515分光光度法分光光度法实际测定中选用参比的重要性1/28/20231/28/20231616分光光度法分光光度法解 已知T=0.501，则A=lgT=0.300，b=2.0cm,则根据朗伯比尔定律 A=abc，而=Ma=64.0gmol-13.00102 Lg-1cm-1=1.92104(Lmol-1cm-1)例9-1 浓度为25.0g/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数。已知M(Cu)=64.0

13、。1/28/20231/28/20231717分光光度法分光光度法例例9-29-2 某有色溶液，当用1cm比色皿时，其透光度为T，若改用2cm比色皿，则透光度应为多少？解解解解:由由A A=-=-lglgT T=abcabc可得可得 T T=10=10-abcabc 当当b b1 1=1cm=1cm时，时，T T1 1=10=10-acac=T T 当当b b2 2=2cm=2cm时，时，T T2 2=10=10-2ac2ac=T T2 21/28/20231/28/20231818分光光度法分光光度法桑桑德德尔尔（San-dellSan-dell）灵灵敏敏度度S S:当仪器所能测出最小吸光度

14、A=0.001时，单位截面积光程内所检测出来的吸光物质的最低量，单位是ugcm-2。S和的关系推导如下：A=0.001=cb，故 c的单位是molL1，即mol(1000cm3)1，b的单位是cm，则cb单位为mol(1000cm2）1，再乘以吸光物质摩尔质量M（gmol1）就是单位截面积光程内吸光物的质量，即为S，所以将上式中的bc代入得1/28/20231/28/20231919分光光度法分光光度法例9-3 用氯磺酚法测定铌，50mL溶液中含铌50.0g，用2.0cm比色皿测得吸光度为0.701，求桑德尔灵敏度。解:已知A=0.701，b=2.0cm，M(Nb)=92.9gmol-1则根据

15、朗伯一比尔定律可得根据式（9-9），桑德尔灵敏度S为1/28/20231/28/20232020分光光度法分光光度法评比结果IIIIII总定1离子交换78318 王宁宁冯晨虓俞泽奇林辉方文斌2气浮分离56718 徐霞王静熊皓舒孙莉莉3离子交换46313 陈宏桦杨中威郑波4绿色化学等多个39214 叶佳吕延龙 孙 汪5气浮分离32712 宋小莉胡罕琼于欣慰6液相色谱3159 李咏江孙珍贺丽汪惠惠7离子交换1124 王鹏飞黄子帅董潇李晋超8离子交换3227 李夏唐颖陈欢9萃取分离3115 张哲宋跃通李季10固相微萃取2226 曹玲陈天然11离子交换4 4 潘茜罗小燕江慧洪碧圆12超临界流体1146

16、 韦嘉佳孙翔393938116 离子交换苏宁海姜兴隆周亮微波萃取孙厦11321/28/20231/28/20232121分光光度法分光光度法 定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲，见图9-4中的虚线。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差。9.2.2 偏离朗伯一比尔定律的原因1/28/20231/28/20232222分光光度法分光光度法 朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸

17、光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。单色光不纯所引起的偏离1/28/20231/28/20232323分光光度法分光光度法由于溶液本身的原因所引起的偏离 吸吸光光系系数数k k与与溶溶液液的的折折光光指指数数n n有有 关关。溶溶 液液 浓浓 度度 在在0.01molL0.01molL-1-1或或更更低低时时，n n基基本本上上是是一一个个常常数数，说说明明朗朗伯伯一一比比尔尔定定律律只只适适用用于于低低浓浓度度的的溶溶液液。浓浓度度过过高高会会偏偏离离朗朗伯伯一一比比尔尔定定律。律。朗朗伯伯比比尔尔定定律律是

18、是建建立立在在均均匀匀、非非散散射射的的溶溶液液这这个个基基础础上上的的。如如果果介介质质不不均均匀匀，呈呈胶胶体体、乳乳浊浊、悬悬浮浮状状态态，则则入入射射光光除除了了被被吸吸收收外外，还还会会有有反反射射、散散射射的的损损失失，因因而而实实际际测测得得的的吸吸光光度度增增大大，导导致致对对朗朗伯伯比比尔尔定律的偏离。定律的偏离。1/28/20231/28/20232424分光光度法分光光度法 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：Fe(SCN)3 F

19、e3+3SCN溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯比尔定律。1/28/20231/28/20232525分光光度法分光光度法9.3 紫外可见分光光度计及测定方法9.3.1分光光度计基本构造 光源(light source)：可见分光光度计都以钨灯（3601000nm）作光源。钨灯是612V的钨丝灯泡，仪器装有聚光透镜使光线变成平行光，为保证光强度恒定不变，配有稳压电源。紫外可见分光光度计除有钨灯外其光源还有氢灯，氢灯发射150400nm波长的光，适用于200400nm波长范围的紫外分光光度法测定。

20、1/28/20231/28/20232626分光光度法分光光度法 单色器(monochromator)：其作用是将光源辐射的复合光分解成按波长顺序排列的单色光。包括狭缝和色散元件及准直镜三部分。色散元件用棱镜或光栅制成。玻璃棱镜的色散波段一般在360700nm，主要用于可见分光光度计中。石英棱镜的色散波段一般在2001000nm，可用于紫外可见分光光度计中。光栅其特点是工作波段范围宽，适用性强，对各种波长色散率几乎一致。1/28/20231/28/20232727分光光度法分光光度法吸收池(absorption cell)又称比色皿，是由无色透明的光学玻璃或熔融石英制成，用于盛装试液或参比溶液

21、。玻璃吸收池：在见光范围内使用。石英吸收池：在紫外光范围内使用。吸收池，通常有0.5cm、1cm、2cm、3cm和5cm宽，可适用于不同浓度范围的试样测定。同一组吸收池的透光率相差应小于0.5%。1/28/20231/28/20232828分光光度法分光光度法检测器(detector)把透过吸收池后透射光强度转换成电讯号的装置。检测系统应具有灵敏度高、对透过光的响应时间短、且响应的线性关系好，对不同波长的光具有相同的响应可靠性。在分光光度计中常用光电管和光电倍增管等做检测器。光电倍增管其灵敏度要比光电管约高200倍。1/28/20231/28/20232929分光光度法分光光度法显示器(dis

22、play)显示器是将检测器检测的信号显示和记录下来的装置。在分光光度计中常用的是微安表、数码显示管等。简单的分光光度计多用微安表。在标尺上有透光度（T）和吸光度（A）两种刻度，由于吸光度和透光度是负对数关系，因此透光度的刻度是均匀的，而吸光度的刻度是不均匀的。1/28/20231/28/20233030分光光度法分光光度法分光光度计的主要类型单光束型单光束型1/28/20231/28/20233131分光光度法分光光度法双双光束型光束型1/28/20231/28/20233232分光光度法分光光度法光电二极管阵列型（光电二极管阵列型（DAD)DAD)1/28/20231/28/20233333

23、分光光度法分光光度法美国热电UV系列P双双光束，光束，1.5 1.5 nmnm可调，光电二可调，光电二极管检测器，计极管检测器，计算机控制算机控制P不能扫描不能扫描1/28/20231/28/20233434分光光度法分光光度法美国热电Helios系列P双双光束，光束，2 nm2 nm可调，光电二极可调，光电二极管检测器，计算管检测器，计算机控制，可扫描，机控制，可扫描，可做导数光度法。可做导数光度法。1/28/20231/28/20233535分光光度法分光光度法美国热电BioMate系列P双双光束，光束，2nm2nm，光电二极管光电二极管检测器，计算检测器，计算机控制，可扫机控制，可扫描，

24、主要用于描，主要用于DNDN蛋白质等的蛋白质等的测定。测定。1/28/20231/28/20233636分光光度法分光光度法美国热电Unicam UV系列P石英镀膜光学元石英镀膜光学元件，件，0.3 nm0.3 nm，全波段扫描，多全波段扫描，多波长检测，光电波长检测，光电二极管检测器，二极管检测器，计算机控制，噪计算机控制，噪声低，稳定性好。声低，稳定性好。US$12000200US$1200020000001/28/20231/28/20233737分光光度法分光光度法美国热电Unicam UV系列PP光路光路系统系统1/28/20231/28/20233838分光光度法分光光度法美国Ag

25、ilent 6010PP全波长扫描，三波长检测，自动波长校正，全波长扫描，三波长检测，自动波长校正，0.5 nm0.5 nm可可调调1/28/20231/28/20233939分光光度法分光光度法上海天美8500型P全波长扫描，三波长检测，自动波长校正，全波长扫描，三波长检测，自动波长校正，0.5 0.5 nmnm1/28/20231/28/20234040分光光度法分光光度法上海棱光S20系列1/28/20231/28/20234141分光光度法分光光度法上海棱光S50系列1/28/20231/28/20234242分光光度法分光光度法9.3.2分光光度测定的方法P标准曲线法配制一系列浓度不

26、同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c曲线，若符合朗伯比尔定律，则得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多次使用而不必重新制作，因而标准曲线法适用于大量的经常性的工作。1/28/20231/28/20234343分光光度法分光光度法Blank Standard Sample Sample1/28/20231/28/20234444分光光度法分光光度法1/28/20231/28/20

27、234545分光光度法分光光度法 标准对照法(直接比较法)将试样溶液和一个标准溶液在相同条件进行显色、定容，分别测出它们的吸光度，按下式计算被测溶液的浓度。k标=k测 b标=b测所以 要求A与c线性关系良好，被测样品溶液与标准溶液浓度接近，以减少测定误差。用一份标准溶液即可计算出被测溶液的含量或浓度，方便，操作简单。1/28/20231/28/20234646分光光度法分光光度法 3吸光系数法在没有标准品可供比较测定的条件下，按文献规定条件测定被测物的吸光度，从样品的配制浓度、测定的吸光度及文献查出的吸光系数即可计算样品的含量，因为 则样品含量1/28/20231/28/20234747分光光

28、度法分光光度法例9-4 已知维生素B12在361nm条件下a标=20.7Lg1cm1。精确称取样品30mg，加水溶解稀释至1000mL，在波长361nm下，用1.00cm吸收池测得溶液的吸光度为0.618，计算样品维生素B12的含量。解：解：A A=a a样样bcbc则则维生素维生素B B1212的含量的含量=1/28/20231/28/20234848分光光度法分光光度法9.4.1 显色反应及显色剂：这这种种被被测测元元素素在在某某种种试试剂剂的的作作用用下下，转转变变成成有有色色化化合合物物的的反反应应叫叫显显色色反反应应（color color reactionreaction），所所加

29、加入入试剂称为试剂称为显色剂显色剂(color reagent)(color reagent)。常常见见的的显显色色反反应应大大多多数数是是生生成成配配合合物物的的反反应应，少少数是氧化还原反应和增加吸光能力的生化反应数是氧化还原反应和增加吸光能力的生化反应。显色剂显色剂9.4 显色反应及其影响因素1/28/20231/28/20234949分光光度法分光光度法显色反应的要求：选选择择性性好好 所所用用的的显显色色剂剂仅仅与与被被测测组组分分显显色色而而与与其其它共存组分不显色，或其它组分干扰少。它共存组分不显色，或其它组分干扰少。灵灵敏敏度度要要足足够够高高 有有色色化化合合物物有有大大的的

30、摩摩尔尔吸吸光光系系数数，一般应有一般应有10104 410105 5数量级。数量级。有有色色配配合合物物的的组组成成要要恒恒定定 显显色色剂剂与与被被测测物物质质的的反反应要定量进行，生成有色配合物的组成要恒定。应要定量进行，生成有色配合物的组成要恒定。生生成成的的有有色色配配合合物物稳稳定定性性好好 即即要要求求配配合合物物有有较较大大的的稳稳定定常常数数，有有色色配配合合物物不不易易受受外外界界环环境境条条件件的的影影响响，亦亦不不受受溶溶液液中中其其它它化化学学因因素素的的影影响响。有有较较好好的的重现性，结果才准确。重现性，结果才准确。色色差差大大 有有色色配配合合物物与与显显色色剂

31、剂之之间间的的颜颜色色差差别别要要大大，这样试剂空白小，显色时颜色变化才明显。这样试剂空白小，显色时颜色变化才明显。1/28/20231/28/20235050分光光度法分光光度法 9.4.2影响显色反应的因素 显色剂的用量显色剂的用量显色反应一般可表示为M+R MRM+R MR1/28/20231/28/20235151分光光度法分光光度法 溶液的酸度 许多显色剂都是有机弱酸或有机弱碱，溶液的酸度会直接影响显色剂的解离程度。对某些能形成逐级配合物的显色反应，产物的组成会随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。另外，某些金属离子会随着溶液酸度的降低而发生水解，甚至产生沉淀，使稳定性较低的有

32、色配合物的解离。1/28/20231/28/20235252分光光度法分光光度法显色温度 有些反应需要加热。有些显色剂或有色配合物在较高温度下易分解褪色。此外温度对光的吸收及颜色深浅也有影响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。显色时间 显色反应有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的显色反应需放置不同的时间，并在一定的时间范围内进行比色测定。1/28/20231/28/20235353分光光度法分光光度法副反应的影响 例如，被测金属离子M与显色剂R反应，生成有色配合物MRn，此时，若M有配位效应，R有酸效应，影响M配位反应的完全程度。通常，当金属离子有99%以上被配位时，就可认为反

33、应基本上是完全的。共存离子的影响 吸光度增加，造成正干扰。被测组分或显色剂的浓度降低，引起负干扰。1/28/20231/28/20235454分光光度法分光光度法9.5 紫外可见分光光度法的误差和测量条件的选择9.5.19.5.1 分光光度法的误差分光光度法的误差 溶液不遵守朗伯溶液不遵守朗伯比尔定律所引起的误差比尔定律所引起的误差 利用标准曲线的直线段来测定被测溶液的浓度，从利用标准曲线的直线段来测定被测溶液的浓度，从而减少由入射光为非单色光引起的误差；也可以利而减少由入射光为非单色光引起的误差；也可以利用试剂空白和确定适宜的浓度范围来减少由溶液本用试剂空白和确定适宜的浓度范围来减少由溶液本

34、身所引起的误差。身所引起的误差。光度测量误差光度测量误差 吸光度与透光率是负对数关系，故吸光度的标尺刻吸光度与透光率是负对数关系，故吸光度的标尺刻度是不均匀的。一般来说透光率为度是不均匀的。一般来说透光率为20206565（吸光（吸光度为度为0.20.70.20.7）时，浓度测量的相对误差都不太大。）时，浓度测量的相对误差都不太大。这就是分光光度分析中比较适宜的吸光度范围。这就是分光光度分析中比较适宜的吸光度范围。1/28/20231/28/20235555分光光度法分光光度法仪器误差 比色皿的质量，检流计的灵敏度。，光源不稳定、棱镜的性能、安装条件及光电管的质量等都可以使分析产生误差。操作误

35、差 由分析人员所采用的实验条件与正确的条件有差别所引起的，如显色条件和测量条件掌握得不好等。1/28/20231/28/20235656分光光度法分光光度法9.5.29.5.2分光光度法测量条件分光光度法测量条件的选择的选择入射光波长的选择 以最大吸收波长max为测量的入射光波长。在此波长处，摩尔吸光系数最大，测定的灵敏度最高。若干扰物在max处也有吸收，在干扰最小的条件下选择吸光度最大的波长。有时为了消除其它离子的干扰，也常常加入掩蔽剂。1/28/20231/28/20235757分光光度法分光光度法 吸光度读数范围的选择透光度读数误差T是常数，但在不同的读数范围内所引起的浓度的相对误差不同

36、。为提高测量的准确度，一般控制被测液吸光度A在0.20.7(透光度为65%20%)。当溶液吸光度超范围时，可通过改变称样量、稀释溶液及选择不同厚度比色皿来控制吸光度。1/28/20231/28/20235858分光光度法分光光度法参比溶液的选择P反射和吸收带来的误差。P纯溶剂空白 当试液、试剂、显色剂均为无色时，用纯溶剂（或蒸馏水）作参比溶液。P试剂空白 试液无色，而试剂或显色剂有色时，加入相同量的显色剂和试剂,作为参比溶液。P试液空白 试剂和显色剂均无色，试液中其它离子有色时，用不加显色剂的溶液作为参比溶液。1/28/20231/28/20235959分光光度法分光光度法9.6 紫外可见分光

37、光度法应用实例P应用:P 测量试样微量组分P 测定配合物的组成及稳定常数、弱酸的解离常数、化学反应的速率常数、催化反应的活化能等.P 根据分子的紫外光谱数据判断分子的空间构型，确定分子结构。1/28/20231/28/20236060分光光度法分光光度法9.6.1单组分含量测定实例一实例一：1,10-1,10-二氮菲测定微量铁二氮菲测定微量铁该试剂能与该试剂能与FeFe2+2+形成形成3:13:1的红色配离子：的红色配离子：maxmax=512nm=512nm，=1.1104Lmol=1.1104Lmol-1-1cmcm-1-1。在。在pHpH为为3 3 9 9范围内，反范围内，反应能迅速完成

38、，且显色稳定。应能迅速完成，且显色稳定。在铁含量在铁含量0.50.5 8 8 g gmLmL-1-1范围内，浓度与吸光度符合范围内，浓度与吸光度符合朗伯朗伯比尔定律。用比尔定律。用pH=4.5pH=4.5 5.05.0的缓冲液保持其的缓冲液保持其酸度，并用盐酸羟胺还原其中的酸度，并用盐酸羟胺还原其中的FeFe3+3+，用标准曲线，用标准曲线法进行测定。法进行测定。1/28/20231/28/20236161分光光度法分光光度法实例二实例二：磷钼蓝法测定全磷：磷钼蓝法测定全磷用浓硫酸和高氯酸用浓硫酸和高氯酸(HClO(HClO4 4)处理样品，使磷的各种形式处理样品，使磷的各种形式转变为转变为H

39、 H3 3POPO4 4，然后在，然后在HNOHNO3 3介质中，介质中，H H3 3POPO4 4与与(NH(NH4 4)2 2MoOMoO4 4反应形成磷钼黄杂多酸，反应如下：反应形成磷钼黄杂多酸，反应如下：HH3 3POPO4 4+12(NH+12(NH4 4)2 2MoOMoO4 4+21HNO+21HNO3 3=(NH=(NH4 4)3 3POPO4 412MoO12MoO3 3+12NH+12NH4 4NONO3 3+12H+12H2 2OO用适当的还原剂如维生素用适当的还原剂如维生素C C将其中的将其中的Mo(VIMo(VI)还原为还原为Mo(VMo(V)，即生成蓝色的磷钼蓝，其

40、最大吸收波长为，即生成蓝色的磷钼蓝，其最大吸收波长为 maxmax=660nm=660nm，用标准曲线法可测得样品的全磷含量。，用标准曲线法可测得样品的全磷含量。1/28/20231/28/20236262分光光度法分光光度法9.6.2多组分含量测定P 溶液的总吸光度等于各溶液的总吸光度等于各组分的吸光度之和：组分的吸光度之和：A=AA=A1 1+A+A2 2+A+A3 3+A+An nP吸收峰互不重叠吸收峰互不重叠PA A、B B两组分的吸收峰相两组分的吸收峰相互不重叠，则可分别在互不重叠，则可分别在处用单组分含量测定法处用单组分含量测定法测定组分测定组分A A和和B B。1/28/2023

41、1/28/20236363分光光度法分光光度法吸收峰相互重叠A A、B B两组分的吸收峰相互重叠，两组分的吸收峰相互重叠，可分别在和处测出可分别在和处测出A A、B B两组分两组分的总吸光度的总吸光度A A1 1和和A A2 2，然后根据吸，然后根据吸光度的加和性列联立方程：光度的加和性列联立方程：在在 AmaxAmax处，处，A A1 1=1 1A AbcbcA A+1 1B BbcbcB B在在 BmaxBmax处，处，A A2 2=2 2A AbcbcA A+2 2B BbcbcB B式中式中 1 1A A、1 1B B分别为分别为A A和和B B在波长在波长 A Amaxmax处的摩尔

42、吸光系数处的摩尔吸光系数 2 2A A、2 2B B分别为分别为A A和和B B在波长在波长 B Bmaxmax 处的摩尔吸光系数处的摩尔吸光系数1/28/20231/28/20236464分光光度法分光光度法吸收峰相互重叠解联立方程组便可得两组分的浓度。解联立方程组便可得两组分的浓度。实际操作时实际操作时1)1)组分数不能过多，组分数不能过多，3434个以下可行个以下可行;2)2)往往方程数往往方程数mm多于组分数多于组分数n;n;3)3)相关数据多编制特殊软件用计算机处理。但要注相关数据多编制特殊软件用计算机处理。但要注意，意，“病态方程病态方程”处理时的特殊点。处理时的特殊点。1/28/

43、20231/28/20236565分光光度法分光光度法导数分光光度法 导数光谱是指吸收光谱对波长的一阶或多阶导数对波长的函数.。获得导数光谱的方法有三：光光学学法法(波长调制、双波长扫描等)、电电子子学学法法(电子微分法)和数数值值微微分分法法(将光谱数字化后进行拟合、平滑和求导等处理)1/28/20231/28/20236767分光光度法分光光度法导数分光光度法的应用导数分光光度法的应用导数分光光度法分辨两个紫外光谱相近组份图例1/28/20231/28/20236868分光光度法分光光度法导数光谱消除宽背景吸收干扰图例1/28/20231/28/20236969分光光度法分光光度法9.6.

44、3配合物组成的测定物质的量比法 固定一种组分如金属离子M的浓度，改变配位剂R的浓度，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，配位剂与金属离子的浓度比值为横坐标作图。当金属离子全部被配位剂配合后，再增加配位剂，其吸光度亦不会增加了，利用外推法可得一交叉点D，D点所对应的浓度比值就是配合物的配合比。1/28/20231/28/20237070分光光度法分光光度法 连续变化法连续变化法 设配位反应为 M+nR MRnM为金属离子，R为配合剂。并设cM和cR为溶液中M和R两组分的浓度，cM+cR=c0（常数）金属离子和配位剂的物质的量分数分别为：配制一系列不同xM（或xR）值的溶液，溶液中配合物浓度随x

45、M而改变，当xM（或xR）与形成的配合物组成相当时，即金属离子和配位剂物质的量之比和配合物组成一致时，配合物的浓度最大。根据与最大吸光度对应的x值，即可求出n。1/28/20231/28/20237171分光光度法分光光度法1/28/20231/28/20237272分光光度法分光光度法9.6.4 紫外分光光度法定性分析简介比较吸收光谱曲线法：比较吸收光谱曲线法：不饱和有机化合物（特别是含共轭体系的有机化合物）既含有未共享的n电子又含有电子，其中的*跃迁吸收谱带和n-*跃迁吸收谱带属于紫外可见特征吸收光谱。可以将在相同条件下测得的未知物的吸收光谱与标准谱图进行比较来作定性分析。如果吸收光谱的形

46、状，包括吸收光谱的 、吸收峰的数目、位置、拐点以及等完全一致，则可以初步认为是同一化合物。1/28/20231/28/20237373分光光度法分光光度法山梨酸标样雪碧样品1/28/20231/28/20237474分光光度法分光光度法有机化合物构型构象的判断P有机化合物构型确定图例1/28/20231/28/20237575分光光度法分光光度法紫外标准光谱图及有关手册紫外标准光谱图及有关手册P“Sadtler Standard pectra(Ultraviolet)”Heyden,London,1978.P“Ultraviolet Spectra of Aromatic Compounds”

47、Wiley,New York,1951.P“Handbook of Ultraviolet and Visible Absorption Spectra of Organic Compounds”New York,Plenum,1967P“Oranic Electronic Spectral Data”利用标准图谱定性利用标准图谱定性1/28/20231/28/20237676分光光度法分光光度法 利用利用Woodward-Woodward-FieserFieser规则和规则和ScottScott规则定性规则定性 根据Woodward-Fieser规则和Scott规则来计算最大吸收波长，并与实验值进行比较，来确认物质的结构。Woodward-Fieser规则是计算共轭二烯、多烯烃及共轭烯酮类化合物 的经验规则。该规则主要以类丁二烯结构作为母体得到一个最大吸收的基数，然后对连接在母体上的不同取代基以及其他结构因素加以修正，得到一个化合物的 总值。用Scott规则来计算芳香族羰基衍生物和取代苯的 。其方法类似于Woodward-Fieser规则。1/28/20231/28/20237777分光光度法分光光度法